Трансгенные мыши: методология

Вектор для позитивно-негативной селекции обычно содержит следующие элементы: I) два блока последовательностей (НВ1 и НВ2), гомологичных отдельным участкам сайта-мишени; 2) трансген (ТG), кодирующий новую функцию реципиента; 3) последовательность, кодирующую устойчивость к соединению G-418 (Nеоr); 4) два разных гена тимидинкиназы (tk1 и tk2) вируса простого герпеса типов 1 и 2 (HVS-tk1 и HVS-tk2) (рис. 5, А). Ключевым для позитивно-негативной селекции является взаимное расположение этих элементов. Трансген и ген устойчивости к G-418 (Neоr) должны находиться между двумя участками ДНК, гомологичными сайту-мишени, а гены HVS-tk1 и HVS-tk2 - по бокам этой конструкции. Если встраивание происходит в случайный сайт (не в НВ1 и НВ2), то с высокой вероятностью вместе с другими последовательностями интегрируют один или оба гена НVS-tk (рис. 5, А). Напротив, если интеграция происходит в результате гомологичной рекомбинации путем двойного кроссинговера в нужный сайт, то в геном встроятся только трансген и ген Neоr, а гены НVS-tk — нет (рис. 5, Б). При выращивании трансфицированных клеток в присутствии G-418 клетки, не несущие ген Neоr, расти не будут. Выживут только клетки, в которых произошла интеграция - иными словами, осуществляется позитивная селекция. Если одновременно с G-418 в среду добавить ганцикловир, то рост клеток, синтезирующих тимидинкиназу, будет подавлен, поскольку этот фермент катализирует превращение ганцикловира в токсичное соединение, летальное для клетки, т. е. произойдет негативная селекция. Клетки, прошедшие через такое двойное сито, скорее всего будут содержать последовательность, встроившуюся в нужный сайт. Хоть этот метод не застрахован от ошибок, он позволяет обогатить клеточную популяцию клетками, несущими трансген в специфичном хромосомном сайте.

 

Электропорация

Этот метод основан на способности клеточной мембраны, становиться проницаемой для экзогенных молекул ДНК под действием импульсов высокого напряжения. Когда различия в потенциалах на внешней и внутренней поверхности мембраны превысят определенный уровень, формируются временные поры, через которые способны проходить экзогенные молекулы. Изменение количества пор в мембране обратимо при условии, что величина или продолжительность импульсов высокого напряжения не превысит критического предела. Размер пор зависит от длины импульсов, силы электрического поля, а также ионного состава среды.

 
 Электропорация.

 

Электропорация была проведена, например, для эмбрионов креветки и моллюсков. Недостатком использования электропорации является постепенная деградация и уменьшение экспрессии трансгена со временем.

 

Биобаллистическая трансформация

Суть метода биобаллистической трансформации заключается в том, что на мельчайшие частички вольфрама, платины или золота, диаметром от 0,1 до 3,5 мкм, напыляется векторная ДНК, содержащая необходимую для трансформации генную конструкцию. Вольфрамовые, платиновые или золотые частички, несущие ДНК, на целлофановой подложке помещаются внутрь биобаллистической пушки. Суспензия животных клеток или эмбрионов, на ранней стадии развития, помещается под биобаллистическую пушку на расстоянии 10-25 см. В пушке вакуумным насосом уменьшается давление до 0,1 атм. В момент сбрасывания давления частички металла с огромной скоростью выбрасываются из пушки и, пробивая мембраны, входят в цитоплазму и ядра клеток. Обычно клетки, располагающиеся непосредственно по центру, погибают из-за огромного количества и давления частичек металла, в то время как в зоне 0,6-1 см от центра будут находиться трансформированные клетки (Рис.3). Далее клетки или эмбрионы животных переносят на среду для дальнейшего культивирования и регенерации. 
            Бомбардировка микрочастицами была использована, например, для трансформации оплодотворенных яйцеклеток креветки, морского ежа. Процент выживших клеток после бомбардировки составляет приблизительно 70%, а также была доказана экспрессия трансгена у некоторых разновидностей рыб.  
Главным преимуществом данного метода является высокая эффективность встройки векторной ДНК, а также то, что можно получить трансгенные клетки в самые кратчайшие сроки.

 
 Биобаллистическая трансформация.

Существенным недостатком этого метода является то, что эмбрионы, подвергшиеся бомбардировке, довольно редко развиваются в полноценных взрослых особей, большая часть из них рано или поздно гибнет.

 Липофекция 
            Липосомы - это сферические образования, оболочки которых состоят из фосфолипидов. Их можно получить в результате резкого встряхивания или обработки ультразвуком водных эмульсий фосфолипидов. 
             Метод липофекции основан на взаимодействии между положительно заряженными молекулами фосфолипидов, из которых состоят липосомы, и отрицательно заряженными молекулами ДНК. В настоящее время предложены три модели ассоциаций между ДНК и фосфолипидами . Суть первой модели состоит в том, что положительно заряженные липосомы присоединяются к отрицательно заряженным молекулам ДНК. Число липосом, присоединившихся к ДНК, зависит от размеров молекулы нуклеиновой кислоты. Во втором случае молекулы ДНК "проглатываются" липосомами, то есть ДНК электростатически взаимодействует с внутренней поверхностью липосомы. В третьем случае молекула ДНК окружена несколькими молекулами фосфолипидов, которые формируют своеобразную ленту с нуклеиновой кислотой.

 
 Липофекция (2-я модель).

Липосомы, несущие положительный заряд, легко присоединяются к несущей отрицательный заряд плазматической мембране животных клеток, после чего путем эндоцитоза проникают в цитоплазму клеток. Механизмы же, обеспечивающие встраивание в геном и экспрессию ДНК, не достаточно изучены. 
К преимуществам данного метода можно отнести низкую токсичность липосом по отношению к клеткам, а также то, что экзогенный генетический материал защищен от действия нуклеаз посредством транспортировки в липосомах. Недостатком данного метода является то, что количество личинок, экспрессирующих трансген сокращается с возрастом.

 

Более простой способ идентификации ЕS-клеток, несущих трансген в нужном сайте, основан на использовании ПЦР. В этом случае ДНК-вектор содержит два участка, гомологичных сайту-мишени, по одному со стороны трансгена и со стороны клонированной бактериальной или синтетической (уникальной) последовательности, отсутствующей в геноме мыши (рис. 6). После трансфекции ЕS-клеток этим вектором проводят скрининг трансфицированных клеток методом ПЦР. Один из ПЦР-праймеров (Р1) комплементарен участку клонированной бактериальной или синтетической (уникальной) нуклеотидной последовательности интегрировавшего вектора, а второй (Р2) — участку хромосомной ДНК, прилегающему к одному из гомологичных участков ДНК. При встраивании последовательности-мишени в случайный сайт ожидаемый продукт амплификации образовываться не будет (рис. 6, А), а при сайт-специфической интеграции в результате ПЦР-амплификации образуется фрагмент ДНК известного размера (рис. 6, Б), Таким образом можно идентифицировать пулы ЕS-клеток, содержащих трансген в нужном сайте, а пересевая клетки из этих пулов — получить клеточные линии с сайт-специфической вставкой.

ЕS-клетки, в геном которых в нужном сайте встроен трансген, можно культивировать и ввести в эмбрион на стадии бластоцисты, а затем имплантировать такие эмбрионы в матку псевдобеременных «суррогатных» матерей. Мышата, у которых генетически модифицированные ЕS-клетки участвовали в образовании клеток зародышевой линии, могут дать начало трансгенным линиям. Для этого их нужно скрестить с особями той же линии, а затем скрестить их трансгенных потомков. В результате будут получены трансгенные мыши, гомозиготные по трансгену.

В специфический хромосомный сайт ЕS-клеток можно не только встроить трансген, кодирующий какую-то новую функцию, но и направленно разрушить этот сайт интеграцией с его кодирующей областью специфической последовательности (обычно селективного маркерного гена) (рис. 7). Одна из задач направленного нарушения («нокаута») гена состоит в исследовании влияния этого процесса на развитие организма и протекающие в нем физиологические процессы. Кроме того, есть надежда, что трансгенных животных с нарушением в определенном гене можно использовать как модель для изучения болезней человека на молекулярном уровне.

Например, направленный «нокаут» гена родопсина мыши приводит к инактивации палочек сетчатки, что имитирует такую болезнь человека, как пигментный ретинит. На мышах с «нокаутированным» геном родопсина можно изучать процесс дегенерации сетчатки, а также терапевтический эффект лекарственных средств, замедляющих или вообще останавливающих генетически обусловленный патологический процесс. Уже создано более 250 линий мышей с «нокаутированными» генами, используюшихся в качестве моделей для изучения различных заболеваний человека.

В принципе подходы к созданию трансгенных животных с «улучшенными функциями» и с «потерей функций» сходны. К сожалению, плюрипотентные ЕS-клетки, аналогичные таковым у мышей, пока не обнаружены у крупного рогатого скота, овей, свиней и цыплят, но их поиск продолжается.

Рис. 4. Получение трансгенных мышей с помощью генетической модификации эмбриональных стволовых клеток.

 

Рис. 5. Позитивно-негативная селекция. А. Неспецифическая интеграция. В хромосому встроились оба гена тимидинкиназы (tk1 и tk2), два участка ДНК, гомологичные специфичным последовательностям хромосомной ДНК реципиентных клеток (НВ1 и НВ2), ген (Neor), обеспечивающий устойчивость к цитотоксическому соединению G-418, и трансген (ТG). После трансфекции проводят тестирование клеток на устойчивость к G-418 и ганцикловиру, который становится цититоксичным для клеток, синтезирующих тимидинкиназу. Интеграция может произойти и по-другому, со встраиванием в хромосому только гена тимидинкиназы. В присутствии G-418 и ганцикловира все такие клетки тоже погибают. Б. Специфическая интеграция с помощью гомологичной рекомбинации. В результате двойного кроссинговера между гомологичными участками (НВ1 и HB2) векторной и хромосомной ДНК в последнюю встраивается фрагмент, не содержащий генов тимидинкиназы (tk1 и tk2). В присутствии G-418 и ганцикловира выживают только клетки, в которых прошла гомологичная рекомбинация.

 

 

Рис. 6. Идентификация клеток, несущих трансген в специфическом сайте, при помощи ПЦР. А. В результате неспецифического встраивания векторной ДНК один из праймеров (Р2) не сможет гибридизоваться с участком хромосомы, находящимся на определенном расстоянии от места отжига праймера Р1, и фрагмента нужного размера при амплификации не образуется. Р1 гибридизуется с уникальным участком (US) встроенной ДНК, отсутствующим в хромосомной ДНК клетки-реципнента. Б. В результате гомологичной рекомбинации между участками НВ1 и НВ2 встраиваемой ДНК, с одной стороны, и комплементарными участками хромосомы СS1 и СS2, с другой, образуются участки, с которыми могут гибридизоваться оба праймера, Р1 и Р2, и которые находятся на определенном расстоянии друг от друга. В ходе ПЦР-амплификации синтезируются фрагменты одного размера, которые можно идентифицировать при помощи гель-электрофореза. Если ПЦР-продукт нужной длины образовался, значит трансген (ТG), находящийся между гомологичными участками (НВ1 и НВ2), встроился в определенный сайт хромосомы.

 

Рис. 7. «Нокаут» гена с помощью направленной гомологичной рекомбинации. Вектор несет селективный маркерный ген (smg) и фланкирующие его последовательности, гомологичные соответствующим участкам гена-мишени. Последний содержит пять экзонов (1 – 5). В результате гомологичной рекомбинации (штриховые линии) ген-мишень прерывается («нокаутируется»).

 

Клонирование с помощью переноса ядра

Плюрипотентность можно выявить, если перенести ядро тестируемой клетки в яйцеклетку с удаленным ядром и затем исследовать способность последней к развитию и образованию жизнеспособного потомства. В нескольких лабораториях с переменным успехом исследовали плюрипотентность линий эмбриональных клеток, клеток плода и взрослой особи. Было показано, что ядра эмбриональных клеток способны - хотя и с низкой эффективностью — обеспечивать развитие. Например, с помощью переноса ядер эмбриональных клеток крупного рогатого скота, культивированных непродолжительное время, были получены жизнеспособные особи. Всем известная овца по имени Долли была клонирована с помощью переноса ядра клетки молочной железы (вымени) взрослого животного (рис. 8). Так впервые была доказана плюрипотентность ядра дифференцированной взрослой клетки. Впрочем, нельзя исключить, что на самом деле донорское ядро было взято из недифференцированной клетки, присутствовавшей в эпителии молочной железы организма-донора.

Клонирование Долли из ядра дифференцированной клетки и трех других овец из ядер эмбриональных клеток удалось осуществить благодаря переносу ядер из клеток, находящихся в стадии покоя (G0), и, возможно, особенностям эмбриогенеза этого животного. Дело в том, что в течение первых трех делений зиготы овцы, занимающих несколько суток, происходит только репликация ДНК, ни один из генов не экспрессируется. Предполагается, что за это время введенная ДНК освобождается от специфичных для клетки регуляторных белков, а соответствующие гены эмбрионального развития связываются с инициаторными эмбриональными белковыми факторами из цитоплазмы яйцеклетки.

Основная проблема, которую нужно решить для того, чтобы создание трансгенных животных с помощью метода переноса ядер стало реальным, — это сохранение плюрипотентности клеток в непрерывной культуре. Если это удастся, то генетическое изменение таких клеток и создание трансгенных организмов станет почти рутинной процедурой. Однако вследствие видовых различий во времени процесса деления клетки на ранних стадиях эмбриогенеза и инициации транскрипции в этот период пока не ясно, удастся ли осуществить перенос ядра в случае каких-либо других домашних животных, кроме овец, если донорское ядро будет находится на той же стадии, что и яйцеклетка.

Рис. 8. Клонирование овцы методом переноса ядра. Ядро яйцеклетки удаляют с помощью микропипетки. Культивируют эпителиальные клетки молочной железы взрослой особи и индуцируют их переход в фазу Gо. Осуществляют слияние клетки в Go-фазе и яйцеклеток, лишенных ядра, и выращивают восстановленные яйцеклетки в культуре или в яйцеводе с наложенной лигатурой до ранних стадий эмбриогенеза, а затем имплантируют их в матку «суррогатной» матери, где и происходит дальнейшее развитие. В эксперименте, описанном Уилмутом и др., было проведено слияние 277 яйцеклеток с удаленными ядрами с клетками молочной железы в фазе Gо; из 29 эмбрионов только один развился до жизнеспособного плода.

Перенос генов с помощью искусственных дрожжевых хромосом

Хромосомы высших организмов содержат в своем составе протяженные молекулы ДНК. Например, длина ДНК одной из типичных хромосом человека составляет 100–200 миллионов пар оснований (м.п.о.). Исследование генов в хромосомах высших растений, животных и человека потребовало создания векторов для клонирования фрагментов ДНК длиной в несколько сотен тысяч пар оснований. Этим задачам отвечает недавно созданная система для клонирования сверхдлинных молекул ДНК на основе искусственно полученной мини-хромосомы дрожжей YAC (yeast artificial chromosome). YAC-вектор представляет собой кольцевую молекулу ДНК, содержащую ряд генетических элементов, которые позволяют ей существовать во внехромосомном состоянии в клетках дрожжей (рис. 9).

Вектор заключает в себе две теломерные последовательности нуклеотидов TEL, необходимые для репликации концов мини-хромосомы, и область начала репликации ARS1, соединенную с последовательностью центромеры. Все эти функциональные элементы требуются для репликации YAC-вектора и его правильной передачи в дочерние ядра во время митоза. Кроме того, вектор содержит два селектируемых маркера TRP, восстанавливающих способность к росту ауксотрофных по триптофану клеток дрожжей в отсутствие экзогенного триптофана, а также маркер URA3, компенсирующий генетический дефект клеток дрожжей, который нарушает биосинтез урацила. В векторе имеется также ген супрессорной тРНК sup4, являющийся селектируемым маркером для поддержания вектора в мутантных бактериальных клетках, содержащих амбер-мутации в жизненно важных генах. Помимо этого, он обладает последовательностями нуклеотидов, необходимыми для его репликации в бактериальных клетках.