Ультра структура средних отделов пищеварительной системы трехмесячных особей дальневосточного трепанга

Грунты в бухте Северная  преимущественно песчаные, илисто-песчаные в западной части, а в северной и центральной переходят в илы. В кутовой части бухты расположены подводные валы, сложенные из песчано-галечных наносов. На содержание донных осадков оказывают существенное влияние выносы из устьев ручьев и реки Брусья.

На траверсе мыса Щелкунова и  вблизи от него на расстоянии 120-150 м  грунты представлены гравием, щебнем, битой ракушей, камнями и валунами различной величины

В центре бухты Северная распространена аккумулятивная пелитовая равнина. Спокойный гидродинамический режим  и слабое волновое воздействие способствует аккумулятивным процессам, где происходит накопление тонкого пелитового материала.

Горловина б. Миноносок и северное побережье бухты Северная сильно заилены, также как и мелководье у м. Сергеева. [6]

По характеру водообмена с открытым морем, степени проникновения и воздействия морских волн на берега и подводный склон б. Северная может быть отнесена к вторичным полузакрытым отмелым бухтам [Мануйлов, 1990].

Гидрологический режим в бухте нестабильный и во многом зависит от ветрового и конвективного перемешивания вод. Основные поступления водных масс из Славянского залива проходят вдоль северо-восточного побережья бухты в вершинную часть, где образуется круговорот, а выход их осуществляется ближе к центральной части бухты.

В апреле-мае в бухте наблюдается  проникновение более холодных вод  из Славянского залива. Они распространяются вдоль восточного побережья в вершинную часть бухты. Мыс Щелкунова является  барьером на пути холодного течения, он также защищает эту часть бухты Северной от преобладающих в это время северо-западных ветров, вследствие чего образуется зона с менее выраженной динамикой вод. К концу круговороты, четко выраженные в апреле-мае, приобретают размытые очертания. Большое влияние на формирование гидрологического режима оказывает поступающие с материка распресненные воды реки Брусья.

Температурный режим б.Северная, также как и солевой подвержен значительным изменениям, как в разные сезоны, так и в разные годы. В целом температура воды находится в прямой зависимости от типа гидрологического режима и динамических процессов вод Славянского залива.

Годовые амплитуды температуры  составляют 23,5-24,5°С – на поверхности  и 20,0-21,0°С – в придонных слоях. Наибольшая разница между поверхностными и придонными температурами отмечаются в июне-июле (то 5,0 до 5,5°С) – в центральной и (3,0-3,6°С) – в мелководной части бухты. В остальные месяца эта разница незначительна. Ранней весной  и до апреля температура воды как на поверхности, так и у дна практически одинакова.

В сезонном ходе изменения солености воды в бухте прослеживается максимум в зимний и минимум в летний периоды года. При сгонном ветре соленость воды увеличивается на 0,2‰_. Перепады  солености между поверхностными и придонными слоями может достигать 11,6‰. Весной  самая высокая соленость до 33‰ наблюдается у устья реки, это в поверхностных слоях. Далее в мористую часть бухты соленость повышается,  но очень незначительно. Летом, например в июне, самая низкая соленость на поверхности четко прослеживается в участках у устьев рек и в мористой части бухты значения ее также невысокие (до 20‰).  Такое понижение солености воды летом происходит вследствие берегового стока и усиление осадков.

В придонном слое воды, как весной, так и летом соленость  высокая в пределах 31 -33,3‰. В осеннее  время в период ливневых дождей и  тайфунов соленость воды очень низкая (до 5,0‰), которая может оставаться в таких пределах в течении недели. [6]

В сезонном изменении  содержания кислорода в б. Северная прослеживается два максимума. Первый весной – 8,3 – 8,5 мг/л и второй (такой же) зимой, что связанно с фотосинтезом. При сгонных ветрах содержание кислорода  понижается на 2-5 %.

Абсолютный максимум относительного содержания  кислорода  в весеннее - летний период может достигать больших величин (от 123 до 150%). В придонном слое насыщенность отмечается в апреле-мае и осенью. В остальное время года процентное содержание кислорода несколько ниже и составляет 85-97 %.

Изменение рН водной среды связаны с процессами образования и распада органического вещества. Величина коррелируется с изменением температуры воды, солености и содержанием кислорода. рН на поверхности зимой уменьшается, а летом увеличивается. На рН в значительной степени сказывается влияние стока рек, впадающих в бухту.

Щелочность, как известно, позволяет проследить распространение речных стоков. Влияние речного стока уменьшает щелочность, а подток вод из открытого моря увеличивает ее.

Биогенные вещества происходят от жизнедеятельности морских организмов. Основная роль в повышении количества питательных солей принадлежит материковому стоку.  В летнее время содержание их минимально, а зимой – максимально.

Эколого-токсикологическая  ситуация в б.Северная приемлема для марикультуры. Загрязненность воды не велика. Концентрации тяжелых металлов (цинка, меди, свинца) в кутовой части ниже, чем в центре и на выходе, и по всей толще воды не превышает ПДК.

Донные беспозвоночные. Бухта Северная довольно богатая по содержанию промысловых беспозвоночных. В зарослях водорослей и морских трав обитают ракообразные, такие как чилимы, раки – отшельники, камчатский краб, краб стригун и прибрежные крабы. Из моллюсков часто встречаются хитоны, брюхоногие: умбониум, литорины, нептунеи, букциниды, мурициды (рапана, церостома, оценебра, нуцелла и бореотрофон). Двустворчатые моллюски представлены разнообразными видами – это тихоокеанская мидия, мидия Грея, модиолис, мускулисты, септиферы, приморский и японский гребешки, калитака, макома и др.

 

 

 

Рис.2. Карта-схема участка марикультуры НЭЦМК Дальрыбвтуза в бухте Северной Славянского залива. [5]

 

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА

Материал для работы взят в летний период 2009 года в НЭЦМК Дальрыбвтуза в б. Северная.

Для изучения ультраструктуры нервной системы молоди ДВ трепанга было необходимо: взять материал, префиксировать, дофиксировать, промыть, постфиксиовать, провести обезвоживание, инфильтровать промежуточными растворителями, пропитать заливочной смолой, заключить в смолу и перевести ее в твердое состояние, изготовить полутонкие срезы (ПС) и ультратонкие срезы, или ультрасрезы (УС), окрасить (контрастировать) УС и просмотреть их.

Трехмесячных особей фиксировали в течение 24 ч в 2.5% растворе глутарового альдегида (ГА), приготовленном на 0.05 М какодилатном буфере (pH 7.4). В основе механизма действия ГА лежит стабилизация белковых молекул с образованием поперечных связей, что является особенно важным для сохранения их локализации в клетке. В то же время непрочность ряда связей, образуемых ГА, а также то, что фосфолипиды и ненасыщенные липиды не стабилизируются при этой фиксации, вызывает необходимость дополнительной фиксации в четырёхокиси осмия (ЧО). [3]

Дофиксация производилась 1 час 1% раствором OsO₄. ЧО взаимодействует с липидами по месту двойных связей. Кроме того, ЧО «окрашивает» субмикроскопические структуры клеток. ЧО действует и как мордант, т.е. вещество, которое способно связываться с красителем, усиливая контрастность структуры в ЭМ.

Материал выдерживали в декальцинирующем растворе (аскорбиновая кислота + NaCl). Затем проводили последовательное обезвоживание в этиловом спирте и ацетоне и заливали в смесь аралдита и эпона согласно методике. [4]

Срезы изготовляли на ультрамикротоме Ultracut E (Reichert).

Контрастирование

Биологические структуры  в большинстве своем электронно-оптически прозрачны. Наиболее эффективным подходом увеличения контрастности изображения является химическое контрастирование — искусственное увеличение электронной плотности ультраструктур. За счет осаждения электронно-плотных веществ контрастирование может быть позитивным - усиление электронной плотности исследуемых структур по сравнению с фоном, окружающим объект, и негативным - увеличение электрон ной плотности фона. В первом случае электронно-плотные вещества осаждаются на клеточных структурах, во втором они вводятся в среду, окружающую исследуемые структуры. [3]

Окрашивание полученных срезов осуществлялось методом позитивной микроскопии, состоящий из двух этапов.

Первый этап контрастирования заключался в двадцатиминутном выдерживании ультратонких срезов в 1% растворе уранилацетата (УА) на 10% этаноле. УА реагирует главным образом с фосфатными, карбоксильными и аминогруппами и имеет особенно сильное сродство к нуклеиновым кислотам. Последние, а также ряд белков интенсивно окрашиваются. УА хорошо проникает в ткань и может использоваться как в водных, так и в спиртовых растворах. Спиртовые растворы проникают в ткань быстрее и обеспечивают более высокую контрастность. УА лучше растворяется в метаноле.

Второй, заключительный этап контрастировании –  пятнадцатиминутное выдерживание УС в цитрате свинца (ЦС). ЦС связывается с отрицательно заряженными компонентами, такими как гидроксильные группы, реагирующие с осмием области. В этот процесс вовлечены и фосфатные группы. [4]

Окрашенные срезы просматривались и фотографировались на трансмиссионном электронном микроскопе Libra 120 Karl Zeiss.

 

 

 

 

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Трехмесячные особи  трепанга имели длину 2-6 мм, средняя длина около 3 мм. Амбулакральные ножки и щупальца хорошо развиты. Стенка тела полупрозрачная, содержит многочисленные округлые спикулы.

 

У молоди трепанга нервная система полностью сформирована и имеет типичное для голотурий строение (рис.3)

Радиальные нервы и  окологлоточное нервное кольцо характеризуются  двумя типами клеток – нейронами  и глиальными (поддерживающими) клетками. Подобное клеточное строение характерно и для других голотурий [7].

Поддерживающие клетки состоят из расширенной чашеобразной апикальной части и тонкой ножки. Ножка проходит через всю толщу нейроэпителия.  Апиколатеральные области поддерживающих клеток соединяются с соседними клетками посредством десмосом (рис.4, г). Большую часть клетки занимает округлое ядро с крупными глыбами хроматина. Наиболее характерной морфологической особенностью поддерживающих клеток является наличие в их цитоплазме пучков промежуточных филаментов, которые простираются от расширенной апикальной части клетки до терминальных окончаний ножек (рис.4, а).

Тела и отростки нейронов заполняют пространства между поддерживающими  клетками и их ножками. Нейроны равномерно распределены по всей толще нейроэпителия  и не образуют каких либо выраженных скоплений (рис.4, б). Схожую ультраструктурную организацию нервной системы у голотурий отмечали и другие исследователи [12].

От радиальных нервных  тяжей отходят пучки отростков, иннервирующие различные органы (рис.4, в).

 

 

 

Рис.3. Схема строения нервной системы голотурий.

гн – гипонейральная часть радиального тяжа; нк – окологлоточное нервное кольцо; рнт – радиальный нервный тяж; эн – эктонейральная часть радиального тяжа.

 

 

 

 

  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис.4. Гистологическая организация  нервной системы молоди дальневосточного трепанга.

А – Участок эктонейрального  кольца. Б – тело нейрона, располагающееся  в толще нерва. В – общий  вид периферического нервного пучка. Г – Участок радиального нерва (поперечный срез). Бм – базальная мембрана; дм – десмосомы; мт – митохондрии; нп – нейропузырьки; от – отросток глиальной клетки; пр – просвет эпинейрального канала; ф – филаменты; я – ядро.

 

4. ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ

Основные правила  безопасности при работе в химической лаборатории

1. Запрещается допускать студентов, аспирантов и сотрудников к работе в лаборатории без ознакомления с настоящей инструкцией. Прохождение инструктажа отмечается росписью в лабораторном журнале по технике безопасности. Ответственность за это несет руководитель лаборатории.
2. Во время работы в лаборатории соблюдайте чистоту, порядок и правила техники безопасности, так как беспорядочность, поспешность или неряшливость в работе часто приводят к несчастным случаям с тяжелыми последствиями.
3. Запрещается в лаборатории пить воду, принимать пищу, курить.
4. Все химические реактивы следует хранить только в соответствующей посуде с этикетками.
5. Студентам запрещается приступать к работе, не согласовав плана работы с руководителем.
6. По окончании пользования газом, водой и электроприборами немедленно закройте краны, которыми вы пользовались и отключите электроприборы. Уходя из лаборатории, проверьте окончание химических процессов, включены ли газ, вода и электрический ток на столах, под тягами и затем в наружных шахтах.
7. Лица, нарушающие правила безопасности, привлекаются администрацией к ответственности. [11]

 

Правила работы с кислотами и горючими веществами

1. Разбавление серной кислоты производить приливанием кислоты в воду, а не наоборот, и только в жаростойких и фарфоровых стаканах, так как при этом происходит значительное выделение тепла.
2. Переливать крепкие HNO₃, H₂SO₄ и HCl можно только при включенной тяге в вытяжном шкафу. Дверцы шкафа должны быть, по возможности, прикрыты.
3. При работе с крепкими кислотами необходимо одевать защитные очки, а при работе с дымящей HNO₃, кроме очков, надевать длинный резиновый фартук.
4. Запрещается при работе с этиловыми эфиром, спиртом, бензолом, ацетоном, уксусноэтиловым эфиром и др. горючими и легковоспламеняющимися жидкостями (ЛВЖ) проводить нагревание на голом огне, на сетке, вблизи открытого пламени или в открытых сосудах. Следует иметь в виду, что легколетучие органические жидкости могут воспламеняться при отсутствии открытого пламени, при падении на сильно нагретую поверхность.
5. Запрещается ЛВЖ выливать в ведра, банки для мусора во избежание пожара от случайно брошенной спички.