Значение вирусов для решения общебиотехнологических проблем

 
Ретровирусы 
В качестве носителей рекомбинантного генетического материала официально использовалось только лишь несколько известных ретровирусов позвоночных. В большинстве утвержденных методик переноса генов применяются ретровирусные векторы. Эти векторы прикрепляются к клеточной поверхности через интерактивный домен оболочечного протеина с последующим опосредованным рецептором эндоцитозом. Первоначально большинство ретровирусных векторов основывалось на вирусе мышиной лейкемии Малони. Он считается относительно безопасным, хорошо изучен, и его генетические особенности достаточно известны и понятны. Однако совсем недавно главными в ретровирусной генотерапии стали лентивирусы. В отличие от большинства ретровирусов, лентивирусы не требуют для инфицирования делящихся клеток. Ретровирусы могут вставлять гены в геном клеток хозяина, что обеспечивает более длительную экспрессию трансгена, но может вести к мутациям в момент ввода. Размер вставки относительно невелик по сравнению с аденовирусами.[11]

Исследователи обычно используют репликационно-дефектные ретровирусы, не содержащие часть генов природного типа, с целью получения нужных количеств инфекционных частиц. Однако сейчас возрастает интерес к применению реплицированных ретровирусных частиц при лечении рака. Дело в том, что первичная инокуляция опухоли традиционно производится путем инъекции, которая не всегда ведет к трансфицированию всех опухолевых клеток. Реплицированные вирусы, высвобождаемые из раковых клеток в межклеточное пространство, могут приводить к тому, что все злокачественные клетки становятся трансфектными или погибают. Однако при продуцировании ретровирусных векторов достигаемые при этом титры невелики по сравнению с некоторыми другими векторами. Кроме того, их отличает высокая степень генетической вариабельности из-за ошибок обратной транскриптазы, что может приводить к значительным уровням мутаций, вплоть до 5%, и вообще к непредсказуемым последствиям. Поскольку некоторые ретровирусы требуют активно делящихся клеток, данный подход имеет перспективы в плане лечения опухолей центральной нервной системы, так как он обеспечивает селективную трансфекцию митотически активных опухолевых клеток. Кроме того, мозг обладает определенной привилегией с точки зрения иммуногенности, обеспечивающей ему возможность ослабления иммунной реакции на вектор, а спинномозговая жидкость не инактивирует ретровирусы. 
 
Аденовирусы 
Аденовирусные векторы, применяемые для генной терапии, генетически модифицируются путем деления различных компонентов вирусного генома, в результате чего создаются промежутки для вставки посторонних генов, и вирус становится неспособным к репликации при внедрении в хозяина. При использовании с самыми разными типами клеток эти векторы обладают высокой эффективностью трансдукции. Они могут готовиться с высокими титрами и не включают ДНК в геном клетки-хозяина. Однако их экспрессия часто снижается уже через 2 недели и становится совсем незначительной через 4 недели, возможно, вследствие индуцирования иммунных реакций на вирусный или трансгенный белок. Совсем недавно появились рекомбинатные аденовирусы, которые притупляют иммунную реакцию хозяина, что позволяет экспрессировать гены в течение более продолжительного времени. Некоторые из новейших аденовирусных векторов могут включать очень большие трансгены. Обычно аденовирусы не являются причиной литических инфекций или острой нейротоксичности.

 
Адено-ассоциированные  вирусы

Адено-ассоциированные вирусы способны заражать клетки только при содействии неродственных вирусов-помощников (обычно аденовирусов). Они встраиваются в геном хозяина и остаются там в качестве провируса до тех пор, пока не появится вирус-помощник. Как только это произошло, может начаться транскрипция с участием генов, заимствованных у вируса-помощника. Эти вирусы не требуют репликации в клетке-мишени для ее инфицирования и способны инфицировать большое количество культур клеток человека, тестированных к настоящему времени. Однако вектор этого типа довольно трудно продуцировать с высокими титрами. Показано, что они могут экспрессировать трансгены до 3 месяцев. Продемонстрирована также способность адено-ассоциированных вирусных векторов хорошо реплицироваться в клетках глиомы. Отсюда можно предположить, что эти векторы могут быть полезными для использования трансгенов, имеющих отношение к центральной нервной системе.

 
Другие вирусные вектора

Представляет интерес  в этом плане вирус простого герпеса, поскольку он может вызывать латентную инфекцию центральной нервной системы. Стали известными несколько первых случаев их применения для доставки трансгенов к опухолям мозга. Среди трудностей использования этих векторов можно привести тот факт, что у данного вируса довольно низка эффективность инфицирования по сравнению с другими вирусными системами, что не дает возможности длительное время поддерживать экспрессию трансгенов, и, кроме того, вирус склонен вызывать нейротоксические и цитопатические эффекты. К тому же у вируса простого герпеса довольно крупный геном и не совсем поняты функции всех его генов.

Существуют гибридные  вектора, содержащие ДНК фага и плазмиды. К ним относятся, например, космиды и фазмиды.

Космиды – плазмидные вектора, в которые встроен участок генома фага λ, обеспечивающий возможность упаковки этой молекулы ДНК в фаговую частицу. Фаговые частицы обеспечивают хорошее проникновение гибридной ДНК в клетку (путем инъекции), после чего происходит замыкание ДНК в кольцо по липким концам и репликация ее по плазмидному типу.

Фазмиды также являются гибридами между фагом и плазмидой. После встройки чужеродной ДНК могут в одних условиях развиваться как фаги, в других – как плазмиды.

 

3. Вирусы в нанобиотехнологии

Современные направления  в нанотехнологиях обещают принести значительно более разностороннее применение вирусам. С точки зрения материаловедов, вирусы можно рассматривать как органические наночастицы. Их поверхность несёт специальные приспособления для преодоления биологических барьеров клетки-хозяина. Точно определены форма и размер вирусов, а также количество и природа функциональных групп на их поверхности. По существу, вирусы часто используют в материаловедении как «подмостки» для ковалентно связанных поверхностных модификаций. Одно из примечательных качеств вирусов — то, что они специально «подогнаны» направленной эволюцией под клетки, выступающие хозяевами. Мощные методы, разработанные биологами, легли в основу инженерных приёмов в наноматериалах, открыв тем самым широкую сферу применения вирусов, выходящую далеко за пределы биологии и медицины.[13]

Из-за своих размеров, формы и хорошо изученной химической структуры вирусы использовали как шаблоны для организации материалов на наноуровне.

 Примером  такой недавней работы могут  служить исследования, проведённые Исследовательской лабораторией Наваля в Вашингтоне (округ Колумбия) с использованием вируса мозаики коровьего гороха (англ. Cowpea Mosaic Virus (CPMV)) для усиления сигналов в сенсорах с ДНК-микрочипами. В данном случае вирусные частицы разделяли частицы флуоресцентных красителей, которые использовались для передачи сигнала, предотвращая, таким образом, скопление нефлуоресцентных димеров, выступающих как гасители сигнала. Другим примером использования CPMV является применение его как наноразмерного образца для молекулярной электроники.[14]

Исследователи Массачусетского технологического института провели оригинальный эксперимент: молекулу ДНК со случайной последовательностью нуклеотидов, кодирующих различные белки, включили в состав ДНК бактериофага в таком участке, чтобы белки на ДНК-доноре синтезировались на поверхности вируса. Колония таких бактериофагов была помещена в среду, к которой исследователи хотели осуществить адгезию белков. После того как поверхность питательной среды была промыта, на ней остались только те вирусы, поверхность которых содержала адгезивные к субстрату белки. Отобранные вирусы поместили в  новую среду и добились роста их колонии. Таким способом можно создавать белки, которые будут соединяться с различными материалами, образуя новые структуры Исследователи надеются создать «библиотеку» вирусов, производящих белки, адгезивные к золоту, платине, серебру, оксиду цинка, арсениду галлия и др. Вирус размножается, образуя при этом длинные нити, покрытые металлом. Последние, несомненно, найдут применение в наноэлектронике и наносистемах.

 

4. Фаготерапия

Применение фагов  в качестве лечебных антимикробных  агентов – одна из наиболее перспективных современных медицинских нанотехнологий. В настоящее время в разработке и производстве лечебных фаговых препаратов лидирующие позиции в мире занимают Россия, Польша, Франция и Грузия.[15]

Взаимодействие фагов с бактерией

Фаги – бактериальные вирусы, воспроизводящиеся в клетках микроорганизмов. Размеры большинства известных фагов варьируются в пределах 50–100 нм. Бактериальный вирус является частицей надмолекулярного уровня организации и состоит чаще всего из нуклеиновой кислоты и нескольких структурных белков.

Взаимодействие  фага с бактерией можно условно  разделить на несколько этапов. Первоначально фаг адсорбируется на определенных рецепторных участках клеточной поверхности. Затем происходит инъецирование (проникновение) фаговой нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) в клетку. С этого момента функционирование всего биосинтетического аппарата микроорганизма изменяется.

В результате такой  перестройки синтезируются компоненты фаговых частиц. Далее в процессе самосборки формируются дочерние фаги (100–200 частиц в одной клетке). Специфические фаговые ферменты разрушают клеточную стенку и освобождающиеся бактериальные вирусы взаимодействуют с другими клетками. Таким образом, фаги репродуцируются в геометрической прогрессии, пока не будет лизирована (уничтожена) вся популяция конкретного микроба.

Концепция фаготерапии

Идея об использовании  фагов в лечении бактериальных болезней возникла сразу же после открытия бактериальных вирусов.

Исследование  свойств фагов в последние  несколько десятилетий способствовало развитию концепции фаготерапии. Применение фагов в качестве лечебных антимикробных агентов – одна из наиболее перспективных современных медицинских нанотехнологий.

Возбудители (патогены) практически всех инфекционных болезней бактериальной этиологии, как правило, устойчивы ко многим антибиотикам. Фаги в сравнении с антибиотиками имеют ряд следующих преимуществ[15]:

= фаги лизируют  антибиотикорезистентные формы  патогенов;

= бактериальные  вирусы не подавляют рост нормофлоры;

= фаги хорошо  проникают в различные ткани  макроорганизма (человека и животного);

= концентрация  фагов в инфекционном очаге  нарастает в результате саморазмножения и быстро снижается после ликвидации инфекции;

= фаги не оказывают  отрицательного влияния на ферментные  системы макроорганизма;

= фаги могут  эффективно использоваться для  профилактики бактериальных болезней.

Следует отметить, что фаги совместимы с другими медикаментами. Возможно применение фагов в сочетании с антибиотиками.

 

5. Вирусотерапия

Каждый вирус  является возбудителем определенного  инфекционного заболевания отчасти потому, что распознает на клеточной поверхности специфические структуры – рецепторы, которые у разных типов клеток неодинаковы. Такая избирательность привлекла внимание онкологов. Если бы ею обладали препараты, используемые в химиотерапии опухолей, то удалось бы избежать многих побочных эффектов, приносящих страдания больным.

Сегодня ученые работают над созданием генетически  модифицированных вирусов, которые  действовали бы как высокоточное самонаводящееся оружие, поражая исключительно раковые клетки и оставляя незатронутыми здоровые клетки. Вирусотерапия – это новое направление в лечении онкологических заболеваний, основанное на применении вирусов, избирательно инфицирующих и уничтожающих раковые клетки. Чаще всего для этой цели используют аденовирусы. При этом создают «искусственный вирус», в геном которого встраивают ген (промотор), позволяющий вирусной ДНК размножаться только в раковых клетках. Миллионы дочерних вирусных частиц, образующихся в раковой клетке, в итоге буквально разрывают ее на части и инфицируют другие раковые клетки. Нормальные клетки тоже инфицируются, но вирус там не размножается и никакого вреда им не причиняет.

Наряду с этим вирусы, использующиеся в вирусотерапии, способны не только физически уничтожать раковые клетки, разрывая их на части, но и доставлять в клетки гены, повышающие их чувствительность к обычным химиотерапевтическим препаратам. Опухолеспецифичные вирусные частицы можно пометить или флуоресцирующими красителями, или радиоизотопами. При попадании их в организм они связываются с опухолевыми клетками, делая последние доступными для обнаружения.[17]

 

 

 

 

 

 

 

Вывод.

Таким образом, роль вирусов биотехнологии заключается  в следующем:

1) борьба против раковых заболеваний

Вирусотерапия - терапия  злокачественных опухолей с помощью  онколитических вирусов, основанная на способности этих вирусов преимущественно размножаться в опухолевых клетках и уничтожать их. Перспективными считаются такие вирусы, как вирус болезни Ньюкастла, вирус кори, вирус везикулярного стоматита, реовирусы, полиовирусы и др. Существуют два варианта вирусотерапии: трансдукционный — основан на создании таких разновидностей обычных вирусов (напр., штаммов аденовирусов, вызывающих острую респираторную инфекцию), которые избирательно инфицируют и разрушают раковые клетки. Выросты на белковой оболочке этих вирусов снабжены адапторными молекулами или содержат модифицированные белки, что не позволяет вирусным частицам связываться с обычными клетками, но способствует распознаванию ими опухолевых клеток. Во втором варианте — транскрипционном — используют вирусы, в геном которых по соседству с одним из жизненно важных генов встроен опухолеспецифичный промотор, который включается только в раковых клетках, и только в них вирусная ДНК может транскрибироваться. Вирусные частицы, образующиеся в раковой клетке, в конечном итоге вызывают ее гибель и инфицируют другие раковые клетки. Нормальные клетки тоже могут инфицироваться, но вирус там не размножается и никакого вреда им не причиняет.

2) Вирусы в нанобиотехнологии

Вирусы часто используют в материаловедении как «подмостки» для ковалентно связанных поверхностных модификаций. Одно из примечательных качеств вирусов — то, что они специально «подогнаны» направленной эволюцией под клетки, выступающие хозяевами. Мощные методы, разработанные биологами, легли в основу инженерных приёмов в наноматериалах, открыв тем самым широкую сферу применения вирусов, выходящую далеко за пределы биологии и медицины.[13]

Из-за своих размеров, формы и хорошо изученной химической структуры вирусы использовали как шаблоны для организации материалов на наноуровне.