Хроматография, как метод анализа лекарственного растительного сырья

Введение.

Фитотерапия и фитопрофилактика сегодня все шире и прочнее внедряются в медицинскую практику. Целесообразно применение лекарственных растений при первичной профилактике ряда заболеваний, поддерживающей или курсовой терапии. В настоящее время ассортимент лекарственных средств растительного происхождения, применяемых в отечественном здравоохранении, составляет более 40%. Не противопоставляя препараты, созданные на основе химического синтеза, лекарственным средствам, созданным на основе лекарственных растений, отметим, что последние обладают в ряде случаев менее выраженными побочными эффектами, обладая, однако несомненной эффективностью. Практикующие врачи должны иметь базовую информацию о современной научной трактовке традиционных подходов к лечению лекарственными растениями для определения их места в комплексном лечении. Это делает проблему изучения химического состава растений чрезвычайно важной и современные хроматографические методы здесь незаменимы. Выявление биологически активных соединений, присутствующих в том или ином лекарственном растении (или группе растений), помогает решению данной задачи, а также позволяет прогнозировать взаимосочетаемость и взаимодополняемость лекарственных растений для составления многокомпонентных сборов.

 В ГФ XI включены 83 статьи  на лекарственное растительное  сырье. Одним из обязательных  разделов при определении подлинности  лекарственного растительного сырья  является раздел «Качественные  реакции», который в настоящее  время включает как собственно  качественные и гистохимические  реакции, так и проведение хроматографического  анализа. Однако качественные реакции  не позволяют с уверенностью  говорить об идентификации сырья, а лишь о присутствии в сырье  определенной группы или ряда  групп биологически активных  веществ, часто не специфических  для данного вида сырья. Только  хроматографическая методика анализа  с использованием стандартных образцов и стандартных хроматограмм позволяет уверенно говорить об идентификации сырья.

Цели данного исследования:

1. изучить хроматографичесике методы в анализе лекарственного растительного сырья;
2. изучить газоадсорбционную хроматографию в анализе лекарственных и ядовитых растений;
3. изучить и дать характеристику хроматографических методов лекарственного растительного сырья.

Задачей данной курсовой является - изучение современного состояния хроматографических методов, внедренных в фармацевтическую практику.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Обзор литературы:

1. Хроматография, как метод анализа лекарственного растительного сырья.

Хроматографический метод анализа был впервые разработан в 1903 г. ботаником М. Цветом для разделения пигментов растений. С тех пор разработаны различные варианты этого метода. Хроматографический метод разделения смеси веществ на компоненты основан на различиях в их физических и химических свойствах, влияющих на скорость распределения веществ из смесей между двумя фазами в условиях направленного относительного движения этих фаз.

При исследовании растений используют различные варианты метода хроматографии, имеющие самостоятельное значение.

Большое значение при исследовании растений приобрела распределительная хроматография, которую в зависимости от способа получения хроматограмм разделяют на бумажную, в тонком слое сорбента и колоночную.

Пользуясь методами хроматографии, можно разделить извлечения из растений на компоненты активных веществ, установить их подлинность, провести количественное определение компонентов, определить степень чистоты растительных препаратов.

 Хроматографические методы.

В соответствии с общей фармакопейной статье Хроматографией называется метод разделения смесей веществ, основанный на их многократном перераспределении между двумя контактирующими фазами, одна из которых неподвижна, а другая имеет постоянной направление движения.

Хроматографические методы анализа используются для разделения смеси веществ или частиц (например, ионов) и основаны на различии в скорости их перемещения в системе несмешивающихся и движущихся относительно друг друга фаз. Поэтому хроматография применяется как на этапе пробоподготовки (очистки анализируемого компонента или смеси компонентов от сопутствующих примесей), так и в ходе непосредственного качественного и количественного анализов. При этом идентификация компонентов проводится по параметрам их удерживания в сравнении со стандартными образцами (свидетелями). Определение содержания искомых соединений или их групп в исходной смеси после хроматографического разделения проводится другими физико-химическими методами в зависимости от способа детекции.

Хроматограмма и хроматографические параметры.

В соответствии с фармакопейной статьёй на хроматографию хроматограмма представляет собой графическое или иное представление сигнала детектора, концентрации веществ в элюате или другой количественной величины, используемой для измерения концентрации веществ в элюате, от времени или объема подвижной фазы. В планарной (плоскостной) хроматографии хроматограммой называют также зафиксированную на бумаге (бумажная хроматография) или ТСХ-пластинке (тонкослойная хроматография) последовательность зон адсорбции веществ

исходной (анализируемой) смеси.

Виды хроматографии.

По механизму разделения различают следующие виды хроматографии, применяемые в анализе лекарственного растительного сырья.

1. Адсорбционная хроматография, в основе которой лежит непрерывный обмен хроматографируемым веществом между неподвижной (твёрдой или жидкой) и подвижной фазами, обусловленный существованием на поверхности раздела фаз динамического равновесия между процессами адсорбции и десорбции хроматографируемого вещества, растворённого в подвижной фазе.

2. Распределительная хроматография, в основе которой лежит процесс непрерывного перераспределения хроматографируемого вещества между подвижной и неподвижной фазами, причём это вещество растворимо в каждой из фаз.

3. Ионообменная хроматография, в основе которой лежит обратимая хемосорбция ионов анализируемого раствора ионогенными группами сорбента. В зависимости от характера ионогенных групп ионообменные сорбенты (иониты) подразделяются на катионообменные (катиониты) и анионообменные (аниониты). Ионообменная хроматография в современном фармакогностическом анализе применяется весьма ограниченно, главным образом для очистки анализируемых компонентов от сопутствующих примесей.

Методы хроматографии.

В анализе лекарственного растительного сырья применяется несколько методов хроматографического разделения, подразумевающих соответствующее аппаратурное оформление.

1. Адсорбционная хроматография на колонках используется главным образом для очистки анализируемых компонентов от сопутствующих примесей. Классическая хроматографическая колонка представляет собой стеклянную трубку, заполненную сорбентом. Для разделения и очистки соединений растительного происхождения чаще всего используют полиамидный сорбент и силикагель, реже применяют колоночную хроматографию на сефадексе и алюминия оксиде. Так, очистку суммы флавоноидов травы сушеницы топяной и плодов боярышника, суммы ксантонов в траве золототысячника проводят с помощью адсорбционной хроматографии на полиамидном сорбенте. Затем в полученном элюате спектрофотометрическим методом определяют содержание действующих веществ.

2. Как вариант адсорбционной и/или распределительной колоночной хроматографии для очистки многокомпонентных смесей растительного происхождения в последнее время всё чаще применяется метод твёрдо-фазной экстракции (ТФЭ). ТФЭ отличается от классической колоночной хроматографии прежде всего принудительной подачей элюента под действием вакуума на выходе из хроматографической системы. Для получения разрежения определенной величины используют специальное герметичное устройство-приёмник (манифолд), в верхней части которого крепятся хроматографические «колонки» (патроны и/или картриджи), а к нижней подключен вакуум-насос с электроприводом.

3. Тонкослойная хроматография, или ТСХ (адсорбционная хроматография в тонком слое сорбента), чаще всего применяется при качественном анализе лекарственного растительного сырья или на стадии пробоподготовки для очистки анализируемых компонентов.

Используют хроматографические пластины с закреплённым или незакрепленным слоем сорбента. Наиболее распространены сорбенты на основе силикагеля, реже применяют алюминия оксид, целлюлозу или полиамидный сорбент. Качественный анализ компонентов лекарственного растительного сырья с применением ТСХ проводят путём детекции невооруженным глазом флуоресценции или окраски пятен в УФ и видимом свете при сравнении со свидетелями. Основным параметром при этом, наряду с характерным окрашиванием или флуоресценцией пятен, является относительное удерживание компонентов, или Rf. Использование метода ТСХ на стадии пробоподготовки в количественном анализе лекарственного растительного сырья предусматривает элюирование действующих веществ с хроматографической пластины и последующий анализ элюата другими методами. Например, разделение суммы флавоноидов цветков боярышника проводят на пластинах «Силуфол» или «Сорбфил», после чего пятно гиперозида элюируют с пластины, а его содержание в элюате определяют спектрофотометрическим методом.

 

На рисунке изображена хроматограмма на пластине гинсенозидов экстракта женьшеня.

 

В последнее время активно развивается метод количественной ТСХ с использованием специального прибора — денситометра, работа которого основана на измерении плотности флуоресценции или окраски пятна анализируемого компонента непосредственно на пластине. Для этого денситометр снабжён цифровой видеокамерой или сканером, а обработка полученных результатов производится с помощью специальной программы на компьютере. Применение денситометрии позволяет проводить экспресс-анализ компонентов сырья без их элюирования с пластины. Производство денситометров активно развивается как в России, так и за рубежом.

4. Использование хроматографии на бумаге (БХ), имеющей как распределительный, так и адсорбционный механизмы разделения компонентов, в настоящее время ограничено и применяется для качественного анализа лекарственного растительного сырья. По способу перемещения подвижной фазы различают восходящую, нисходящую и круговую БХ. Детекцию осуществляют сходным с ТСХ образом. Так, качественный анализ флавонолов листьев вахты трёхлистной проводят с помощью восходящей БХ с последующим проявлением хроматограммы раствором алюминия хлорида.

В самом общем виде все перечисленные методы хроматографии не требуют специального аппаратурного оформления, за исключением количественной ТСХ и твёрдо-фазной экстракции. К строго приборным методам хроматографического анализа относятся газовая и высокоэффективная жидкостная хроматография.

Пример качественного анализа травы термопсиса ланцетовидного, семян термопсиса ланцетовидного методом хроматографии на бумаге.

На полоске хроматографической бумаги (длина 30—40 см, ширина 12 см) на стартовую линию, находящуюся на расстоянии 2—3 см от нижнего края, капилляром или специальной пипеткой наносят около 0,1 мл извлечения В из

травы термопсиса и из семян термопсиса, растворы цитизина, метилцитизина и пахикарпина. Расстояние от бокового края полоски хроматографической бумаги и между пятнами — 2 см. Диаметр пятен не должен превышать 5 мм.

Полоску хроматографической бумаги с нанесенными на нее растворами (после высушивания) помещают в хроматографическую камеру, в которую предварительно (за сутки) налита разделительная система: н-бутанол -уксусная кислота - вода (5 : 1 : 4).

Нижний край хроматограммы погружают в жидкость примерно на 3—5 мм (экспозиция — 14—15 ч).

Посл высушивания хроматограмму обрабатывают (опрыскивают из пульверизатора) реактивом Драгендорфа. На желтом фоне проявляются оранжевые или оранжево-красные пятна (алкалоиды).

5. Газовая хроматография (ГХ) - это хроматография, в которой подвижная фаза находится в состоянии газа или пара. В фармацевтическом анализе находят применение газожидкостная (ГЖХ) и газоадсорбционная хроматографии. В газожидкостной хроматографии неподвижной фазой служит жидкость, нанесённая на твёрдый носитель, т.е. используется распределительный механизм разделения компонентов. В газоадсорбционной хроматографии неподвижной фазой является твёрдый адсорбент.

Достоинствами газовой хроматографии являются:

• сравнительная простота аппаратурного оформления;
• весьма широкие границы применимости (можно определять соединения, для которых достигается давление насыщенного пара 0,001-1 мм рт.ст.);
• возможность определения с высокой точностью малых количеств газов органических соединений с высокой точностью;
• быстрота анализа;
• широкий выбор сорбентов и неподвижных фаз;
• высокая гибкость изменения условий разделения;
• возможность осуществления химических реакций в хроматографической колонке или детекторе, что расширяет круг анализируемых соединений (реакционная газовая хроматография);
• повышение информативности при сочетании с различными инструментальными методами (масс-спектрометрией и ИК (Фурье) спектрометрией).