Саматическая гибредизация

2. ФАКТОРЫ ПОВЫШЕНИЯ  ЭКСПРЕССИИ ТРАНСГЕНОВ В ОРГАНИЗМЕ  ЖИВОТНЫХ

Наряду с низкой эффективностью большинства методов трансгенеза основным лимитирующим фактором получения трансгенных является случайный характер интеграции трансгена в геном. На экспрессию трансгена в организме животных оказывают влияние последовательности, прилегающие кв участку интеграции, что является причиной большой вариабельности уровня экспрессии. Уровень синтеза трангенного продукта может варьировать у различных животных от эктопного до слабого или даже находится ниже порога детекции.

Влияние участка интеграции на уровень  и характер экспрессии объясняется  так называемым позиционным эффектом [Wilson era/., 1990, Sippel et al., 1997). Кроме того, ограниченные знания регуляторных последовательностей большинства генов приводят к использованию зачастую полностью не охарактеризованных геномных фрагментов, что и является причиной низкой эффективности экспрессии в экспериментах по переносу генов [Palmlter, Brinster, 1986].

Для того чтобы преодолеть позиционный  эффект и таким образом увеличить  вероятность оптимальной экспрессии трансгенов, интегированных в случайной локализации, был применен целый ряд различных стратегий.

Первым таким подходом, позволившим  увеличить уровень экспрессии, являлось введение в генные конструкции гомологичных интронных последовательностей.

Положительное влияние на уровень  экспрессии трансгенов оказывало введение в генные конструкции S/MAR-элементов

Наиболее удачным решением проблемы преодоления позиционного эффекта  явилось интеграция в определенный участок генома посредством гомологичной рекомбинации в эмбриональных стволовых  клетках, так как это обеспечивает контроль трансгенной конструкции всеми регуляторными последовательностями, присутствующими в выбранном эндогенном локусе. Оптимальная локализация трансгенов в геноме клетки хозяина может быть выбрана исходя из уровня и характера экспрессии экспериментального трансгена. Еще одним подходом, позволившим дайной интеграции трансгена в геном хозяина является включение в генные конструкции всех регуляторных элементов, ответственных за его экспрессию. Стандартные плазмидные, космидные или фаговые векторы в большинстве случаев не могут быть использованы, вследствие их ограниченной емкости. Данная стратегия может быть использована с применением векторов типа искусственных хромосом, обладающих повышенной клонирующей способностью.

Наиболее широкое применение для  получения трансгенных животных нашли векторные системы на основе YAC (обзоры Montoliuetal. 1993, Jakobovits, 1994, Peterson, 1997, Peterson etal 1997) YAC- эукариотические клонирующие векторы, способные к стабильному сохранению геномных фрагментов ДНК длиной более 1 миллиона п.о. [Burke., 1987]. Они представляют собой линейные фрагменты ДНК, содержащие все необходимые элементы для их сохранения в клетках дрожжей в виде искусственных хромосом. Первые результаты успешного использования YACs в экспериментах по трансгенезу на мышах были получены в 1993 году [Jakobovits et a/., 1993, Schedl et a/., 1993, Strauss etal., 1993].

Для введения YACs в эмбрионы мышей нашли применение три различных подхода: пронуклеарная микроинъекция очищенной в геле YAC-ДНК [Schedl et a/., 1993], липофекция YAC-ДНК в эмбриональные стволовые клетки [Strauss et a/., 1993] и слияние дрожжевого сферобласта с эмбриональными стволовыми клетками [AtoboWte ef a/., 1993). Исследование экспрессии YACs у различных линий трансгенных мышей выявило зависимость уровня экспрессии от числа копии трансгена. С другой стороны, уровень экспрессии не зависел от позиционного эффекта

В то время, как YAC-технологии широко используются для получения трансгенных мышей [обзоры Peterson et al., 1997, Giraldo and Montoliu, 2001) Несколько исселдователай сообщили об успешном создании YAC-трансгенных сельскохозяйственных животных. Были получены свиньи и крысы посредством ксенотрансплатации и направленной экспрессией рекомбинантных генов в молоко трансгенных животных.

Результаты получения трансгенных животных с использованием YAC.

что число молекул YAC, микроинъецируемых в пронуклеус зигот значительно меньше, чем при использовании плазмидных конструкций (это обусловлено большим размером YAC), общая эффективность получения трансгенных сельскохозяйственных животных с использованием векторов на основе УАС практически не отличается от результатов, полученных с использованием стандартных генных конструкций. Так, Brem с соавторами [1996\, используя концентрации YAC-ДНК 1-4 нг/мкл, получили 7,4% трансгенных кроликов, что соответствовало общей эффективности 0,74%. Roue с соавторами инъецировали в пронуклеус зигот кроликов раствор YAC в концентрации 1 нг/мкл и достигли степени интеграции 11,8% при общей эффективности 0,71%. Таким образом, размер инъецируемой ДНК не оказывал существенного влияния на эффективность получения трансгенных животных.

Было установлено, что при микроинъекции YAC в пронуклеос зигот животных часто происходит интеграция в геном только части молекулы. Причиной может быть механическое повреждение молекул ДНК большой длины в ходе приготовления раствора ДНК и микроинъекции в пронуклеос. Чтобы прекратить повреждение добавляют полиамины, которые формируют комплексы с ДНК и стабилизируют ее посредством образования компактных структур.

Не смотря на огромные преимущества векторов на основе YAC , они имеют  ряд недостатков, выражающихся в  определенных трудностях лри создании и подготовке YAC-конструкций. К ним относятся химеризм инсерции (более 50% клонов в YAC библиотеке), нестабильность инсерции, перестройки и потенциальная контаминация эндогенными дрожжевыми хромосомами, что затрудняет их эффективную очистку. С целью исключения таких проблем были созданы другие типы векторов на основе искусственных хромосом, такие как клоны Р1-фага, BAC - "bacterial artificial chromosome", PAC - "P1 bakteriophage-derived artificial chromosome".

Клонирующая система бактериофага Р1 может эффективно сохранять инсерции гетерологичной ДНК размером 70-100 т.п.о. [Stemberg, 1999].

Наряду с YACs BACs используются для выполнения широкого спектра фундаментальных исследований, включающего изучение мутаций, исследование функции и действия генов in vivo, идентификация и анализ регулярных последовательностей, находящихся на значительном удалении от структурного гена. Потенциальные возможности BACs нашли также применение для повышенной экспрессии рекомбинантных белков в молочной железе трансгенных животных [Stinnakre et al., 1999, Zuelke, 1998].

3. ПЕРСПЕКТИВЫ  ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ РАБОТ В ЖИВОТНОВОДСТВЕ

Развитие биотехнологии сельскохозяйственных животных, в том числе генная инженерия, открывает новые возможности  развития животноводства. Уже имеющиеся  результаты по получению трансгенных животных говорят о возможности изменения ряда важнейших хозяйственно-ценных признаков. Например, трансгенные животные (свиньи, куры, кролики) с геном гормона роста при равных условиях характеризуются повышенными темпами роста.

Другим важнейшим направлением генной инженерии является получение  трансгенных особей с интегрированными в геном генными конструкциями, связанными с усилением иммунитета животных к инфекционным заболеваниям.

Третьим актуальным направлением генной инженерии животныж является получение животных продуцентов биологически активных веществ, необходимых в медицине, ветеринарии и технологии переработки продуктов животноводства. Многие биологически активные вещества не могут производиться традиционными методами в достаточных количествах и с желательным качеством. Существует огромный коммерческий интерес к производству этих белков. В сыроделии существует значительный дефицит молокосвертывающих энзимов, в частности, химозина, необходимого для получения высококачественных твердых сортов сыра. Первым экземпляром трангенного животного стала мышь, размерами вдвое превосходящая обычную особь в нее был введен ген, синтезирующий гормон роста крысы. И ученых сразу заинтересовала возможность трансгенеза у сельскохозяйственных животных. Направление, связанное с получением из трансгенных сельских животных человеческих белков уже приближается к стадии коммерциализации. Ученые небезуспешно пытаются синтезировать человеческие белки в бактериях и дрожжах. Но это дорого и технически сложно: из бактериальных культур не всегда удается выделить чистый белок. К тому же некоторые белки невозможно получить в бактериях в силу громоздкости генов, определяющих их синтез. Биореактор в виде коровы или овцы лишен этих недостатков, и он гораздо производительнее, а конечный продукт (белок) получается в десятки раз дешевле. Но началось все опять-таки с мыши. В 1987 году в США вывели трансгенных мышей, в молоке которых содержался тканевый плазмино-генный активатор, способствующий рассасыванию тромбов в человеческих сосудах. После этого успеха направление заинтересовало крупный капитал (рынок лекарственных белков оценивается приблизительно в 10 млрд. долларов), и в надежде на эффективность новой технологии на будущем рынке начали внедряться биотехнологические гиганты, активно инвестируя в НИОКР. За неполные десять лет, прошедшие с американского достижения, от трансгенных коз, овец, свиней, кроликов и даже коров было получено семнадцать лекарственных белков. Причем десять из этих белков выделялись с молоком в приличной концентрации - около одного грамма на литр молока. Это большое количество, поскольку для курса лечения некоторых болезней требуется всего несколько миллиграммов. А сейчас таким способом научились синтезировать гораздо больше белков. Как минимум три препарата, полученных от трансгенных животных, проходят сегодня последние клинические испытания.

Наиболее интересным является использование  молочной железы как продуцирующего органа, т. к. в этом случае жидкость, содержащую рекомбинантные протеины, можно легко извлечь. Кроме того, молочная железа физиологически обладает огромным потенциалом синтеза протеинов. Принципиальная возможность специфической экспрессии трансгенов протеина молока и чужеродных протеинов в молочной железе была продемонстрирована в экспериментах на мышах, кроликах, свиньях, овцах, козах. Среди сельскохозяйственных животных получение и использование трансгенных мелких жвачных значительно дешевле (на единицу биологической продукции), чем коров, т. к. овцы и козы обладают коротким репродуктивным периодом и в случае интенсивной экспрессии соответствующего гена сразу же открывается возможность быстрого размножения трансгенных животных, создание промышленного стада продуцентов и перманентных линий трансгенных животных, экспресси-рующих желаемые протеины. При получении трансгенных животных исследователи стремятся к тому, чтобы все соматические клетки (полная трансгенность) и, в особенности, генеративные клетки, содержали генную конструкцию. В этих случаях интеграция рекомбинантной ДНК приводит к полной трансгенности и при условии достаточной экспрессии обусловливает изменение фенотипа животных и передачу этого признака потомству. Основным способом получения трансгенных животных на сегодняшний день остается микроинъекция рекомбинантной ДНК в мужской пронуклеус ранних зигот. Поэтому микроинъекцию генов осуществляют на максимально ранних этапах развития животного: в большинстве случаев на стадии оплодотворенной яйцеклетки или двуклеточных эмбрионов. Уже имеются трансгенные по гену химозина кролики с промотором казеина крупного рогатого скота, в молоке которых отмечен высокий уровень химозина и доказана его высокая активность. У некоторых кроликов в 1л молока содержится до 1500 мг химозина, а за лактацию от одного кролика можно получить такое количество химозина, которое способно переработать до 10000 кг коровьего молока. Если учесть, что для свертывания 1 тонны молока при производстве сыра требуется 1 г химозина, то для производства сыра в России потребуется лишь 300 кг химозина. Для этого необходимо иметь «биотехнологическую» или «генную» ферму на 5 - 6 коров или 300 овец. Следует подчеркнуть, что главным критерием при выборе подходящего вида животных для «генных» ферм в большинстве случаев должен быть необходимый объем производства. Для производства протеинов в молочной железе в масштабах тонн целесообразно использовать коров, в сотнях килограммов -- овец и коз, а в килограммах -- кроликов (Brinster е.а.,1985).

В настоящее время разрабатываются  и апробируются системы организации  и функционирования биологических  предприятий на племенных фермах, использующих трансгенных овец или коз. Основная и наиболее трудоемкая работа- создание первичных трансгенов с хорошей продукцией (экспрессией ) белка интереса или т.н. «генных ферм». Для достижения этой цели, особенно в молочном козоводстве, затрачены большие материальные и интеллектуальные ресурсы, однако говорить о развитой и действующей биоиндустрии на основе трансгенных овец и коз, особенно в нашей стране, преждевременно. Связано это в первую очередь с тем, что метод микроинъекций в пронуклеус не стопроцентный. Часто случается, что генная конструкция может вообще не встроиться в геном животного, а если и встроится, то может оказаться не во всех клетках. Из трансплантированных яйцеклеток с генной конструкцией прижиться может лишь пятая часть, а встроиться в нужный участок генома - 1-2%. Большого искусства требует и трансплантация зиготы в половые пути самки. Другая проблема - поиск и выделение наиболее эффективных генных конструкции. Проводятся интенсивные опыты с различными животными, с целью получения такой экспрессии белка, которая была бы наиболее экономически выгодной. Сейчас биотехнологи Института биологии гена и МГУ создают конструкцию, которая будет содержать ген, определяющий синтез лактоферрина (белка, отвечающего в женском молоке за иммунитет новорожденного). Сложность заключается в том, чтобы подобрать к этому гену такой промотор, который не просто заставит его работать в ткани молочной железы, а работать эффективно, то есть вызывать наибольший уровень экспрессии нужного белка. Как правило, первые опыты обычно проводятся с мышами. В отличие от крупных животных их проще и дешевле содержать, они быстро доходят до половозрелого возраста, поэтому меньше времени уходит на получение и размножение трансгенных особей для последующего их изучения. Далее наблюдают, какие яйцеклетки прижились, в каких животных генная конструкция встроилась в активную часть генома. В лучшем случае из ста яйцеклеток может получиться один-два трансгена (Эрнст Л.К., 1993, Clark A.J. е.а., 1989, Pursel V.G. е.а., 1990, Wilmut I.e.a.,1991). Как только в мышином молоке появится желаемый уровень лактоферрина, можно будет переходить на продуктивных сельскохозяйственных животных, в частности, коз. Коза не так плодовита, как мыши, и может родить двух, в лучшем случае трех козлят, поэтому коз в эксперименте должно быть много.