Цитохимическое исследование эритроцитов

Министерство  Здравоохранения Республики Беларусь

Учреждение  образования

Гомельский  государственный медицинский университет

Кафедра Клинической лабораторной диагностики 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Реферат

На тему: «Цитохимические исследования эритроцитов»

 

 

 

 

Подготовил  студент Д-301

Коржев Павел

Проверил  преподаватель

______________________

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Гомель 2010

 

Введение

 

Цитохимические исследования проводят в препаратах (мазках или отпечатках) костного мозга, крови, различных органов  и новообразований, пунктатов; они основаны на использовании специфических химических цветных реакций для определения в клетках различных веществ (под действием специально подобранных реактивов происходит окрашивание тех или иных веществ в цитоплазме, а по степени и характеру окраски судят о количестве или активности исследуемых веществ). Цитохимические исследования относительно несложны, но уступают в точности количественному анализу, проводимому с помощью биохимических методов.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Цитохимические анализы эритроцитов

 

1. В норме ядерные клетки красного ряда дают положительную реакцию на кислую фосфатазу и неспецифическую а-нафтилацетат эстеразу и остаются неокрашенными при ШИК-реакции и при реакции на щелочную фосфатазу.

Наибольшая активность кислой фосфатазы  отмечается в эритробластах, по мере созревания эритроидных клеток активность кислой фосфатазы в них уменьшается. Количество эритроцитов, положительных на кислую фосфатазу, в норме составляет 1,21% (подсчет на 100 000 эритроцитов), по данным В. В. Соколова, Р. П. Нарциссова, Л. А. Ивановой.

Активность неспецифической а-нафтилацетат эстеразы также высока в эритробластах. Она выявляется в виде интенсивного диффузного окрашивания околоядерной зоны. При созревании эритроидных клеток активность этого фермента снижается и в норме лишь в единичных эритроцитах можно обнаружить 1-2 гранулы продукта реакции. Однако у новорожденных, у которых число ретикулоцитов в крови увеличено, активность а-нафтилацетат эстеразы выявляется в 20°/о! эритроцитов в виде 1-3, иногда больше, гранул продукта реакции.

При анемиях различной этиологии, лейкозе, гипоксических состояниях (врожденные пороки сердца) число эритроцитов, положительных на а-нафтилацетат эстеразу, увеличивается, причем наибольший процент эритроцитов (до 90%), дающих положительную реакцию, наблюдается у детей с врожденными пороками сердца синего типа. Активность а-нафтилацетат эстеразы в эритроцитах полностью ингибируется эзерином.

 

 

2. Цитохимическое и биохимическое исследование эритроцитов имеет большое значение в диагностике гемолитических анемий. Цитохимическое определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы по методу Hess и соавторов широко используется для выявления дефицита этого фермента в эритроцитах. По данным С. М. Дульциной, при этой цитохимической реакции эритроциты, не содержащие гранул продукта реакции (формазана), в крови здоровых людей не встречались: в среднем 12Д% эритроцитов содержали до 10 гранул формазана, 79,2% эритроцитовот 11 до 20 гранул, а 8,2% эритроцитов - свыше 21 гранулы.

 

Принцип

 

Окисление глюкозо-6-фосфата в присутствии  Г-б-ФД при участии NADP, который восстанавливается в NADP-H: под влиянием последнего тетразолии выявляется в виде гранул формазана.

 

Реактивы 

10% раствор формалина. 

Инкубационная среда: глюкозо-6-фосфат— 3 мг в 1 мл, NADP — 1 мг в 1 мл, магния хлорид — 0,1 М в 0,2 мл, нитросиний тетразолий — 1 мг в 1 мл, трис-буфер 0,25 М (рН 7,6) — 2,3 мл, феназин-метасульфат — 0,5 мл.

 

Специальное оборудование

Термостат на 37 °С.

Микроскоп.

 

Ход исследования

На нефиксированные мазки крови  наносят 0,1—0,2 мл инкубационной среды  и помещают мазки в горизонтальном положении в термостат на 1 ч 15 мин. Фиксируют в 10 % растворе формалина 10 мин при комнатной температуре. Высушивают на воздухе и микроскопируют.

 

Нормальные величины

В эритроцитах обнаруживают 10—20 гранул формазана.

 

При дефиците Г-6-ФДГ в эритроцитах  нарушается способность превращения  окисленного глютатиона в восстановленный, в результате эритроциты легко подвергаются гемолизу под влиянием окисляющих агентов. При наследственном дефиците Г-6-ФДГ гемолитические кризы могут развиваться после приема некоторых лекарств, а также после попадания через пищевые продукты или вдыхания пыльцы бобов Vicia fava (фавизм).

 

Содержание восстановленной формы  глютатиона в эритроцитах определяется с помощью цитохимической реакции по Барнетту, Зелигману с использованием диокси-диметил-дисульфана. В результате этой реакции эритроциты приобретают диффузную красно-лиловую окраску, интенсивность которой у здоровых людей, как правило, соответствует + + + и не зависит от пола и возраста. У больных гемолитическими анемиями, связанными с дефицитом Г-6-ФДГ, обнаруживается снижение интенсивности окраски эритроцитов.

 

 

3. Биохимические методы используются для определения таких ферментов эритроцитов, как глютатионредуктаза, пируваткиназа, дифосфоглицератмутаза, триозофосфатизомераза, аденоэинтрифосфатаза, альдолаза, метгемоглобинредуктаза, ацетилхолинэстераза, дегидрогеназы лактата, малата, изоцитрата и т. д.. Большая группа гемолитических анемий связана с дефицитом тех или иных ферментов эритроцитов.

 

 

4. Фетальный гемоглобин эритроцитов определяют цитохимически на основе его большой кислотоустойчивости по сравнению с гемоглобином взрослых животных. У здоровых новорожденных в крови преобладают эритроциты, содержащие фетальный гемоглобин (окрашенные эритроциты после кислотного воздействия). У взрослых животных такие окрашенные эритроциты в мазках встречаются в единичных случаях.

 

Метод Бетке

 

Принцип

Элюция гемоглобина кислотой с докраской мазков дает возможность отличить эритроциты, содержащие фетальный гемоглобин, по сохраненной окраске в отличие от обесцвеченных эритроцитов, содержащих гемоглобин А.

 

Реактивы

Цитратно-фосфатный  буфер (рН 3,2): 24,7 мл 0,2 М раствора Na2HPO4 (35,6 г Na2HPO4*2Н2О и до 1 л дистиллированной воды) и 75,3 мл 0,1 М раствора лимонной кислоты (21,01 г лимонной кислоты и до 1 л дистиллированной воды).

1 % раствор  метилового фиолетового или 1 % раствор эозина. Лучшие результаты  дает докраска метиловым фиолетовым.

Этиловый  спирт 80 %.

 

Специальное оборудование

Микроскоп.

Термостат на 37 °С.

 

Ход определения

Фиксируют мазки  крови в 80 % этиловом спирте 5 мин. Промывают  дистиллированной водой и высушивают. Погружают мазки на 5 мин в прогретый  при 37 °С в течение 30 мин цитратно-фосфатный буфер (для элюции гемоглобина), периодически помешивая раствор стеклянной палочкой для удаления пузырьков воздуха. Ополаскивают мазки дистиллированной водой, высушивают фильтровальной бумагой. Докрашивают реактивом 2 в течение 2—3 мин. Промывают дистиллированной водой и высушивают.

Нормальные величины

 

У взрослых встречаются  единичные окрашенные эритроциты (содержащие гемоглобин F); увеличение числа окрашенных эритроцитов наблюдается у новорожденных  и детей до 5-месячного возраста.

 

Увеличение эритроцитов  с фатальным гемоглобином отличаются при  тассемии, различных анемиях, заболеваниях легких, сердечно-сосудистой системы, гемобластозах, некоторых острых инфекциях.

 

5. Негеминовое железо в эритроидных клетках выявляется с помощью реакции берлинской лазури в виде зерен диаметром 0,2-1,5 мкм (железосодержащие гранулы). Нормоциты, содержащие такие зерна, называются сидеробластами, а эритроциты - сидероцитами. В норме 15- 40% нормоцитов костного мозга могут содержать железоположительные гранулы, у здоровых грудных детей сидеробласты составляют 25-80% от всего количества нормоцитов. В крови детей старшего возраста и взрослых в норме от 0 до 3% эритроцитов содержат железоположительные гранулы. У новорожденных, по данным И. Тодорова, процентное содержание сидероцитов в крови повышено (от 3 до 17%), но к 2-3-му дню жизни оно снижается до нормального уровня.

 

Принцип

Окраска с помощью реакции на берлинскую лазурь и образование  внутриклеточных гранул синего цвета.

 

Реактивы

2% раствор железисто-синеродистого  калия. 

0,1 н. раствор НСl (8,2 мл концентрированной НСl и дистиллированной воды до 1 л).

0,1 % раствор сафранина. 

Метиловый спирт.

 

Специальное оборудование

Микроскоп

 

Ход определения

Фиксируют мазки в метиловом  спирте 10—20 мин и высушивают на воздухе. Помещают в смесь равных частей растворов 1 и 2 при температуре 50—56 °С на 15—20 мин. Промывают в проточной воде 10—15 мин и ополаскивают дистиллированной водой. Докрашивают раствором сафранина 3— 5 с.

 

Нормальные величины

В периферической крови число сидероцитов не превышает 1,1 % и составляет в среднем 0,6+0,04%, в костном мозге их несколько больше—0,9± +0,09% (в среднем 0,2—2,1%), количество сидеробластов (ядерных эритроцитов с железосодержащими гранулами) в костном мозге 23,7+2,4 %.

 

Клиническое значение

Снижение сидероцитов и сидеробластов характерно для железодефицитных анемий. Повышение железосодержащих клеток наблюдается при гемолитических анемиях, гипопластических анемиях, после операции спленэктомии.

 

6. Тельца Гейнца определяют с помощью неокисляющих красителей (метиловый фиолетовый и др.). В эритроцитах выявляются одиночные круглые крупные гранулы фиолетового или синего цвета. Появление их в эритроцитах, как и внутриэритроцитарных включений, свидетельствует о наличии патологически нестабильных форм гемоглобина, дефиците ферментов и других формах гемолитической анемии.

 

7. Гликоген в клетках эритроидного ряда в нормальных условиях не выявляется. Положительная реакция на гликоген всегда свидетельствует о патологии. Особое значение эта реакция имеет для диагностики эритролейкоза, когда в эритробластах появляются гранулы ШИК-положительного материала (крупные или средней величины) или интенсивное диффузное окрашивание. Однако надо учесть, что эта реакция бывает положительной при талассемии, а у взрослых при анемии Аддисон-Бирмера.

 

8. При реакции с суданом черным Б в клетках эритроидного ряда наблюдается слабое диффузное окрашивание, не имеющее диагностического значения.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Оценка результатов

 

При цитохимическом исследовании чаще пользуются полуколичественной оценкой  результатов, используя принцип  Астальди, основанный на выявлении различной степени интенсивности специфической окраски. В зависимости от нее исследуемые элементы делят на 4 группы: с отрицательной реакцией (-), слабоположительной (+), положительной (++) и резко положительной (+++). Для количественного выражения результатов подсчитывают 100 клеток определенного вида, дифференцируя их по указанному принципу, затем число клеток с одинаковой интенсивностью окраски умножают на соответствующее данной группе число плюсов, сумма этих произведений составляет условные единицы. Например, при исследовании активности щелочной фосфатазы в нейтрофилах из 100 просмотренных клеток в 60 клетках активность фермента не выявлена (-), в 35 - специфическая окраска была слабой (+) и в 5 - более интенсивной (++). Результат определения активности щелочной фосфатазы в нейтрофилах в таком случае составит (60*0)+(35* 1)+(5*2)=0+35+10=45 ед.

Можно выразить результат в виде среднего цитохимического показателя по L. Kaplow (1955) или среднего цитохимического коэффициента (СЦК). С этой целью также дифференцируют 100 исследуемых клеток по указанной выше системе. Полученный процент клеток в каждой группе умножают на соответствующее данной группе число плюсов. Сумма этих величин, деленная на 100, представляет собой СЦК для одной клетки. В указанном примере СЦК щелочной фосфатазы нейтрофилов равен 0,45.

В тех случаях, когда изучаемые  вещества локализуются в клетках  в виде единичных гранул (например, активность неспецифической эстеразы в лимфоцитах и др.), результат цитохимической реакции целесообразно выражать в процентах клеток, дающих положительную реакцию.

Метод полуколичественной оценки является ориентировочным, но позволяет сравнивать распределение исследуемых веществ  в разных клеточных элементах  или в одних и тех же клетках при различных патологических состояниях организма, а также в зависимости от течения заболевания, степени его тяжести и в связи с проводимой терапией.

Следует иметь ввиду, что цитохимический метод может быть использован только в качестве дополнения к морфологическому исследованию, но не может его заменить. Недостатком всех цитохимических реакций является их приблизительная качественная оценка, основанная на степени интенсивности окраски

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Литература:

 

1. Цитологические аспекты заболеваний системы крови/Под ред. Э. И. Терентьевой, Г. И. Козинца.— М.: Медицина, 1978, с. 162.
2. Исаева Е. Г., Королева А. М. Лаб. дело, 1965, № 4, с. 201;
3. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник

Меньшиков В.В.

4. http://bt2.narod.ru/metod/hem019.htm
5. http://www.clinlab.info/Cytochemical_research.shtml