Генетическое картирование

Генетическое картирование – составление схем, в которых гены расположены в линейном порядке с указанием относительных расстояний между ними. 

Картирование генов грибов

Грибы - эукариотические микроорганизмы, чей генетический аппарат организован в несколько линейных хромосом. Ядро при вегетативном размножении клеток делится митотически, сохраняя обычно постоянным свой набор хромосом. У грибов, имеющих половую стадию, в определенный момент жизненного цикла происходит мейоз, в результате которого из одного диплоидного ядра возникают четыре гаплоидных. При этом происходит рекомбинация генов, т. е. их перераспределение, в результате которого в потомстве гены оказываются представленными в родительских и новых сочетаниях. Изучение особенностей такой рекомбинации позволяет наиболее эффективно решать задачи генетического анализа, в частности определять сцепление генов (выяснять, какие гены располагаются в одной и той же хромосоме, в каком порядке они лежат в хромосомах и, наконец, какое расстояние между генами). Окончательные результаты такого анализа могут быть представлены в виде генетических карт, на которых гены располагаются в определенном порядке и на определенном расстоянии в каждой из хромосом набора, отличающего этот вид организмов.

Принципиальное сходство мейоза у всех эукариотов (грибов, растений, животных) обусловливает сходство закономерностей поведения сцепленных и несцепленных генов у самых разных организмов. Закономерности эти были открыты Г. Менделем и Т. Морганом. Вместе с тем особенности жизненных циклов грибов обусловливают проведение у них генетического анализа такими методами, которые не применяются (или редко применяются) при работе с высшими организмами. Основные принципы и методы генетического анализа грибов и их жизненные циклы изложены в работах .

Прежде чем рассмотреть специфические для грибов методы картирования генов, мы кратко опишем анализ случайной выборки спор, образующихся в результате мейотического деления. Такой анализ в принципе не отличается от анализа расщепления в потомстве скрещиваний высших организмов с одной лишь разницей - у грибов анализируется гаплоидное потомство мейотических спор, у высших организмов - диплоидное потомство, каждая особь которого берет начало от слияния двух гаплоидных гамет.

Картирование генов бактерий

Бактерии - прокариотические микроорганизмы, генетический аппарат которых в основном представлен единственной кольцевой молекулой ДНК, образующей сложную структуру из множества суперспирализованных петель, удерживаемых в компактном состоянии с помощью молекул РНК и белков. Такая скрученная хромосома (folded chromosome), называемая еще ядерным тельцем, или нуклеоидом, связана с мембраной клетки, что является необходимым условием для начала репликации и сегрегации дочерних хромосом в процессе деления клетки. Кроме хромосомы, генетический материал у бактерий может быть представлен также эписомными элементами - профагами и плазмидами, наличие которых не обязательно и нежизненно важно для клетки.

Размер хромосомы бактерий по данным разных методов (генетического: размер трансдуцирующего фрагмента; физических: вискоэластометрический метод, скорость ренатурации, электронная микроскопия) составляет для Pseudomonas aeruginosa 2,1 ⋅ 109Д, для Escherichia coli К-12 - 2,8 ⋅ 109, для Bacillus subtilis - 2,0 ⋅ 109 - 2,6 ⋅ 109 и для Streptomyces coelicolor - 4,7 ⋅ 109 Д. Если исходить из среднего размера гена в 1500 пар нуклеотидов, то бактериальная хромосома может содержать около 3000 генов.

Число хромосом в одной клетке бактерий зависит от стадии развития и физиологических условий роста культуры. При выращивании культуры на богатой среде в условиях хорошей аэрации может быть несколько хромосом в одной клетке вследствие реинициации новых циклов репликации ДНК еще до деления клетки.

Число автономно реплицирующихся кольцевых молекул плазмид определяется системой контроля репликации. При наличии строгого контроля репликации число копий плазмид на одну хромосому невелико, а при ослабленном контроле репликации оно увеличивается на 1-2 порядка, достигая нескольких десятков и сотен копий.

Бактерии как объекты генетических исследований имеют ряд преимуществ перед высшими организмами: они гаплоидны, способны к быстрому и практически неограниченному размножению в довольно простых лабораторных условиях и обладают рядом относительно несложных признаков, удобных для количественного, биохимического и генетического анализов.

В отличие от эукариотических микроорганизмов бактерии обладают разнообразными способами передачи ДНК, ведущими к гетерозиготному состоянию клеток. Почти каждый новый вид микроорганизмов - это новая генетическая система, новый феномен со специфическими особенностями. Не все детали генетического анализа, тщательно разработанные на одной системе, например на Е. coli К-12, в одинаковой степени пригодны для изучения другой системы, например P. aeruginosa или S. coelicolor A3 (3). Следует, однако, отметить, что принципиальные положения или главные приемы, разработанные для классических объектов генетики бактерий, успешно используются для генетического изучения новых групп прокариотических микроорганизмов.

В мире бактерий существует три различных способа переноса генетического материала из одной клетки в другую - конъюгация, трансдукция и трансформация. В последнее время на высших организмах и бактериях успешно и эффективно разрабатывается искусственный способ объединения генетического материала разных клеток путем слияния и регенерации протопластов.

Важное значение для генетического анализа имеют две особенности генетической рекомбинации, обнаруженные у всех исследованных до сих пор бактерий. Первая особенность состоит в относительной редкости генетической рекомбинации в скрещиваемых бактериальных культурах, что, за редким исключением, требует применения селекции рекомбинантов из большой популяции клеток родительских типов. В качестве селектируемых маркеров используют удобные аллели родителей, обусловливающие независимость роста от определенного питательного вещества (прототрофность) или устойчивость к антибиотикам, ядам или вирулентным бактериофагам. Выделенные рекомбинанты затем могут быть классифицированы по отношению к неселективным маркерам путем высева на ряд диагностических сред с добавками факторов роста или отсутствием ингибиторов.

Вторая особенность генетической рекомбинации бактерий, наблюдаемая при каждом из известных в настоящее время способов передачи генетической информации - конъюгации, трансдукции и трансформации, заключается в образовании неполноценных зигот - меродиплоидов - вследствие неодинакового вклада обоих родителей. В то время как генетический материал материнской (реципиентной) клетки представлен в зиготе целой хромосомой, т. е. полным набором генов, материал отцовской (донорной) клетки - только фрагментом хромосомы или частью генома. Образование меродиплоидной зиготы у бактерий сказывается на результатах рекомбинации, обусловливая отсутствие рекомбинантов от единичного или нечетного числа кроссинговеров, так как жизнеспособные рекомбинанты возможны лишь при двойном или четном числе перекрестов между хромосомой реципиента и фрагментом ДНК донорной клетки. Это приводит к уменьшенному вдвое выходу рекомбинантов.

Вклад донора зависит от способа передачи генетического материала, выбора конкретной системы и метода анализа. При трансдукции размер фрагмента хромосомы донора четко ограничен объемом головки бактериофага, в которую может быть ошибочно упакована ДНК хозяина. Например, головка фага Р1 может нести в 2,5 раза больше ДНК, чем головка фага Р22, и в опытах по трансдукции может включать сегмент ДНК Е. coli, равный приблизительно 2,2 % генома клетки, в то время как при генерализованной трансдукции у Salmonella typhimurium фаг может переносить около 1% генома.

При трансформации длина переносимой молекулы ДНК донора очень коротка и зависит как от способа приготовления препарата ДНК, так и от специфики конкретной системы. Размер однонитевой ДНК, участвующей в синапсе при трансформации у В. subtilis, составляет в среднем около 2 МД (около 0,1 % хромосомы). Только при конъюгации размер гетерозиготной области может сильно колебаться и в редких случаях достигать размера полного генома.

Меродиплоидность накладывает определенные ограничения на обнаружение сцепления между генами с помощью измерения частот рекомбинации. Однако данное препятствие можно преодолеть путем применения количественных и качественных тестов сцепления, зависящих только от меродиплоидного состояния и не зависящих от частот рекомбинации между парой локусов. Примером может служить картирование по градиенту переноса маркеров или по времени их вхождения в реципиентную клетку.

Несмотря на перечисленные трудности генетической рекомбинации у бактерий, высокая разрешающая способность методов генетического анализа позволила к настоящему времени картировать с той или иной полнотой хромосомы многих видов бактерий и изучить тонкое строение и функцию отдельных генов.

Картирование генов актиномицетов

Актиномицеты - большая и широко распространенная в природе группа грамположительных бактерий, гетерогенная по строению, развитию и химическому составу входящих в нее представителей и филогенетически родственная по высокому молярному проценту ГЦ-пар ДНК и гомологии 16S-рибосомальной РНК и ДНК-рРНК-цистронов [1, 2, 10].

Клетки актиномицетов имеют диаметр около 1 мкм, форму кокков (род Micrococcus), кокков-палочек (род Arthrobacter), фрагментированных гиф (род Nocardia) и высокодифференцированного, разветвленного мицелия (род Streptomyces). Актиномицеты относятся к порядку Actinomycetales, и по морфологическим признакам их можно условно разделить на две основные группы - нокардиоподобные и кори неподобные бактерии и спороактиномицеты. Нокардиоподобные бактерии (нокардии, родококки, микобактерии) не образуют спор, при размножении гифы распадаются на кокки или палочки и отличаются устойчивым признаком - кислотоустойчивостью клеток. Коринеподобные бактерии не образуют мицелия, иногда сохраняют рудиментарное ветвление и также имеют цикл развития палочка - кокк.

Данная группа актиномицетов насчитывает около 30 родов, отличающихся, кроме морфологических признаков, химическим составом клеток (липиды, сахара, структура и аминокислотный состав пептидогликана). Она включает роды Actinomyces, Actinomadura, Arthrobacter, Brevibacterium, Corynebacterium, Frankia, Micrococcus, Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus и др. Спороактиномицеты имеют вегетативный (субстратный) и репродуктивный (воздушный) мицелий, на котором образуются споры или спорангии, содержащие подвижные или неподвижные споры. К данной группе относятся роды Streptomyces, Streptosporangium и др. Актиномицеты в основном сапрофиты. Патогенные формы вызывают актиномикоз, актиномицетому, нокардиоз, туберкулез, проказу, дифтерию, паршу картофеля и другие поражения растений. Значительное большинство актиномицетов - гетеротрофы (хемоорганотрофы) с разными потребностями в источниках питания. Аэробы и анаэробы. Мезофилы. Представители рода Streptomyces - промышленные продуценты большинства известных антибиотиков.

Из большого числа родов актиномицетов тот или иной способ обмена генетическим материалом к настоящему времени установлен лишь у ограниченного круга родов Nocardia, Rhodococcus, Mycobacterium, Streptomyces.

Генетическое картирование

Метод генетического анализа результатов скрещивания для определения сцепления генов мало приемлем для картирования плазмид. Здесь основными генетическими методами являются комплементационный анализ и картирование с помощью делений, которые успешно были применены для построения карт полового фактора и плазмид лекарственной устойчивости. Главное препятствие на пути генетического анализа - несовместимость плазмид, которая исключает применение цис-транс-тестов для отнесения мутаций к одному или разным цистронам. Однако эту трудность можно преодолеть с помощью остроумных экспериментов для анализа системы переноса половой плазмиды. Под действием мутагенных факторов у плазмид F'lac и F'gal получена большая серия точечных мутантов tra-, классифицированных с помощью набора штаммов-супрессоров на типы сдвига рамки считывания, амбер, охра, UGA и несупрессибельные. Для объединения в одной клетке двух F'-факторов путем скрещивания двух штаммов F' у одного из них были приготовлены клетки F- - фенокопии при разных режимах выращивания культур по отношению к аэрации при 42° С. Гетерогеноты F'/F' можно идентифицировать на среде с лактозой и тетразолием в виде колоний с секторами Lac+/Lac-. Таким образом можно получить гетерогеноты F'/F', в которых еще до исключения одной несовместимой плазмиды произойдет экспрессия генов tra-, что даст возможность применить тест цис-транс. Если две точечные мутации tra- способны к комплементации, то гетерогенота F'/F' способна в течение 45-50 мин переносить, ту или иную половую плазмиду в новую реципиентную клетку.

Таблица 5.2. Конъюгационная комплементация мутаций tra

Рис. 5.1. Карта цистрона tra штамма Hfr KI1000, построенная по результатам комплементации между точечными мутантами F lac tra- и делеционными мутантами К11000. Линии и числа внизу карты - протяженность делеций разных мутантов KI; расстояния на карте изображены произвольно

Схема опыта следующая. Штаммы донора F' lac tra- T6SSu+ (фенотип Tra+ в результате супрессии нонсенс мутации tra-)ск скрещивают с F- - фенокопиями реципиента F- lac- tra- Т6 Spcs Su- и через 45 мин смесь обрабатывают лизатом Т6 с высоким титром фага для убийства клеток донора. Затем клетки реципиента, устойчивые к фагу Т6, испытывают на донорную способность (т. е. на наличие комплементации мутаций tra) в скрещивании со вторым реципиентом F- lac- Т6r Spcr, устойчивым к фагу Т6 и антибиотику спектиномицину (Spcr в настоящее время обозначается rpsE) и не способным использовать лактозу в качестве источника углерода. Через 45 мин скрещивания клетки разобщают и высевают на среду без лактозы, содержащую спектиномицин, для отбора клеток Lac+ Spcr, которые приобрели F'lac исходного штамма. Положительные результаты указывают на комплементацию между двумя F'tra- плазмидами или на рекомбинацию между ними. Эти две возможности можно легко дифференцировать по способности к дальнейшему переносу плазмиды F' от клеток Lac+ Spcr в клетки F-. При комплементации мутаций tra- перенос невозможен, а при возникновении рекомбинантов tra+ повторный перенос неограничен во времени.

Тест на комплементацию двух trа- -мутаций можно также проводить с помощью Р1-трансдукции. Для приготовления лизатов экспоненциальные культуры мутантов F lac tra- обрабатывали фагом Р1. С помощью конъюгационного и трансдукционного тестов комплементации на первом этапе исследований все мутации tra- были классифицированы и отнесены к 11 цистронам tra [5, 9].

Следующий этап генетического анализа системы переноса полового фактора состоял в картировании генов tra с помощью делеционного анализа. Для получения делеций был сконструирован штамм HfrKl 1000 путем интеграции в оперон gal Е. coli К-12 плазмиды F ts 114 lac с мутантным геном репликации и последующей лизогенизации клеток термоиндуцибельным фагом, включившимся рядом с сайтом att. Штамм HfrKl 1000 переносит область рrоС как ранний маркер, a bio и lac - как терминальные маркеры. Когда данный штамм выращивают при 42 °С, индуцируется профаг CI 857 susP3 int-6, убивающий клетки хозяина без образования свободного фага и нормального вырезания профага из хромосомы. Выживают только спонтанные температуроустойчивые мутанты, потерявшие активность гена N профага в результате делеций. Один конец делеций захватывает весь или часть фага лямбда, а другой - интегрированный F lac. Серию делеционных мутантов tra- анализировали с помощью комплементационного теста в конъюгационных и трансдукционных скрещиваниях с набором точечных мутантов F lac tra- из 11 комплементирующих групп. Схема опытов аналогична ранее описанной.