Иммунологические методы

Источником определенных популяций  лимфоцитов могут служить антигенспецифичные Т-клеточные линии, культивируемые в течение длительного периода. Получение таких линий позволяет обойтись без частого выделения первичных культур из органов и тканей животных.

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭФФЕКТОРНЫХ  КЛЕТОК

Разработаны различные методы для  определения эффекторных функций  лимфоцитов, в частности продукции  антител, цитотоксичности и опосредованной Т-клетками помощи и супрессии.

В-клетки, продуцирующие IgM- или IgG-антитела, можно определить при помощи метода локального гемолиза, или реакции  бляшкообразования. Другим способом выявления антителообразующих клеток служит иммуноферментный тест ELISPOT. Он позволяет определять функционально активные Т-клетки, секретируюшие те или иные растворимые медиаторы, т. е. цитокины. Определение проводят на подложке с иммобилизованными антителами к специфическому цитокину. Эти антитела связывают данный цитокин, выделяемый Т-клеткой в окружающую зону, и эффект связывания можно выявить путем соответствующей обработки подложки: вокруг цитокинвыделяющих Т-клеток будут видны окрашенные пятнышки.

Для определения антигенспецифичных Т-клеток часто используют тест стимуляции лимфоцитов — пролиферативный ответ Т-клеток на антиген, выявляемый по включению ими 3Н-тимидина. Цитотоксическую активность клеточных популяций обычно определяют по их способности лизировать клетки-мишени. Количественно лизис клеток-мишеней определяют при помощи теста с высвобождением меченого хрома.

Миграция лимфоцитов

В экспериментах по изучению миграции лимфоцитов in vivo обычно исследуют распределение  в тех или иных тканях введенных  внутривенно мелекул адгезии, метят  лимфоциты или эндотелиальные клетки и используют блокирующие адгезию антитела для иммунопреципитации специфических молекул адгезии.

ТРАНСГЕННЫЕ ЖИВОТНЫЕ И НАПРАВЛЕННАЯ ДОСТАВКА ГЕНОВ

Трансгенные животные

Один из путей для изучения функций той или иной молекулы — это создание трансгенных животных, у которых ген данной молекулы либо делетирован, либо экспрессируется, но на сверхвысоком уровне или с образованием измененного продукта. Оригинальный способ получения трансгенных животных состоит в инъекции примерно ста копий данного гена непосредственно в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки. Яйцеклетку переносят затем в яйцевод ложнобеременной мыши-самки, в матке которой и развивается эмбрион. Потомство таких мышей отличается вариабельностью. У небольшого числа эмбрионов одна или больше копий гена встраивается в одну из хромосом до первого клеточного деления. Эти животные являются гетерозиготами по трансгену. У другой части животных включение трансгена происходит после первого деления, и мыши оказываются химерами, у которых наряду с нормальными клетками имеются клетки, содержащие трансген. У большинства мышей трансген не встраивается в хромосому. Статус каждой мыши определяют путем исследования образцов клеток на присутствие гена, для чего применяют саузернблоттинг. На основании данных анализа отбирают трансгенных гетерозиготных животных, которых затем используют для скрещивания и получения гомозиготной трансгенной линии.

Обычно включение трансгенов в хромосому происходит случайным  образом и в виде блока из нескольких копий. Важно, что при включении трансгенного блока не образуется разрывов в других, функционально важных генах. Характер экспрессии трансгенов зависит от ряда факторов. Иногда эти гены оказываются под контролем промоторов общего типа и экспрессируются в большинстве тканей. В других случаях они связаны с тканеспецифическими промоторами и их экспрессия ограничена лишь некоторыми тканями и клетками или определенными стадиями развития. К интерпретации фенотипа трансгенных животных необходимо подходить с осторожностью, поскольку высокую экспрессию трансгенов в несоответствующих тканях нельзя считать физиологичной.

Направленная доставка гена

Этот более тонкий метод  на первом этапе состоит в переносе гена, который взаимодействует или  рекомбинирует с исследуемым  эндогенным геном и вызывает в результате его изменение. Например, в этом эндогенном гене может произойти делеция, в нем могут возникнуть точковые мутации или выпасть экзон. Такой измененный ген вводят в эмбриональную полипотентную стволовую клетку, где он рекомбинирует с аналогичным эндогенным геном. Эту стволовую клетку переносят затем в бластоцисту или имплантируют описанным выше способом.