История и перспективы развития голографических методов в медицине

Как видно на рисунке 5, естественным недостатком ESPI-метода является неизбежная зернистость изображения, но это может быть преодолено как программными средствами (использованием методов интерполяции и экстраполяции), так и путем записи набора спеклограмм с пространственным сдвигом спекл-поля и последующим синтезом непрерывного изображения.

Рисунок 5 – А: классическая двухэкспозиционная голографическая интерферограмма, отражающая колебание керамической шайбы; В: аналогичная ей картина корреляции фаз, отражающая колебания листа титана при нагреве, полученная ESPI-методом, и рассчитанный по ней профиль деформации листа.

Фазы кодируются цветами (синий – 0, желтый - , зеленый – , красный - ).

Применение в офтальмологии ESPI-метода

Для практических целей (лазерная хирургия глаза, изменение формы хрусталика глаза) очень важны методы определения формы роговицы глаза. Эта задача была решена ESPI-методом с дополнительной модуляцией длины волны лазерного излучения [11]. Данная модификация ESPI-метода заключается в том, что сравниваются два фазовых портрета поверхности тестируемого объекта, полученные при разных длинах волн лазерного излучения . В этом случае на картине корреляции фаз появляются эквифазные полосы, расстояние между которыми по глубине равно

 

Чувствительность метода регулируется изменением величины и может составлять от микрон до сантиметров. Результаты данных работ представлены на рисунке 6.

Рисунок 6 – Установка для определения формы поверхности роговицы изолированного глаза кролика, картина корреляции фаз (расстояние между эквифазными полосами 0,1 мм) и её расшифровка.

Для той же цели может быть использован также иммерсионный метод [12]. В данной модификации второй фазовый портрет снимается после изменения показателя преломления среды, в которую помещается исследуемый объект, т.е. применения или смены иммерсионной жидкости. В этом случае перепад высоты между линиями

 

где — изменение показателя преломления иммерсионной жидкости. На рисунке 7 показан профиль углубления (~ 0,1 мм), оставленного на прозрачном пластике шариком шариковой ручки, составляет в данном случае 0,02 мм.

Рисунок 7 – В данном случае распределение фаз в картине корреляции фаз показано изменениями интенсивности красного цвета (черный – 0, ярко-красный – ).

Не менее важно определение эласто-упругих свойств внешних оболочек глаза. В работе [13] было предложено использовать для этой цели ESPI-метод, но, на наш взгляд, в неудачной модификации. Предлагалось покрывать поверхность роговицы рассеивающим порошком, а в качестве тестирующего воздействия использовать изменение внутриглазного давления при помощи инъекции физиологического раствора NaCl (рисунок 8А). Все это травматично для глаза.

Рисунок 8 – Метод исследования эласто-упругих характеристик глаза: А: метод исследования характеристик тканей глаза; В: принципиальная схема установки аналогичного назначения:

1 – лазер; 2 – расширитель-коллиматор; 3 – диффузный  рассеиватель; 4 – полупрозрачное  зеркало; 5 – зеркало, перемещаемое  пьезокерамикой; 6 – фазовый модулятор  опорной волны; 7 – диафрагма; 8 –  ТВ-камера с компьютерным входом; 9,10 – глаз; 11 – нетравматичное  тестирующее внешнее воздействие (например, изменение внешнего давления  воздуха).

Метод аналогичного назначения [14] лишен этих недостатков (рисунок 8 В). В качестве тестирующего воздействия предложено использовать нетравматические для глаза факторы: изменение внешнего давления, механическое давление, воздушную струю, ультразвук, электрическое поле. На рисунке 9 показаны картины корреляции фаз, полученные при последовательном увеличении внешнего давления. Видно, что деформация роговицы резко асимметрична.

Рисунок 9 – Изолированный глаз кролика. Слева направо – картины корреляции фаз, полученный при последовательном увеличении внешнего давления воздуха.

3. Оптическая когерентная томография

Данный метод базируется на использовании низкокогерентных источников (полупроводниковых лазеров и суперлюминесцентных диодов), широко распространен в офтальмологии и позволяет решать важные задачи, например, диагностировать отслоения сетчатки. Современные приборы позволяют как получать линейные сканы, так и работать в режиме картографирования (рисунок 10). Но их работа связана со сканированием как в плоскости изображения, так и по глубине, что замедляет операцию исследования. Применение в данных приборах методов цифровой голографии и ESPI, не требующих сканирования, позволит существенно увеличить быстродействие приборов ОКТ.

Рисунок 10 – А и В: результаты работы прибора Stratus OКT (Carl Zeiss Meditec в режиме линейного сканирования и картографирования; С: топограмма тестового объекта (полусферическая выпуклость на плоскости), полученная при помощи комбинации методов ОКТ и ESPI без сканирования.

3. Голографическая микроскопия

1. Классическая голография

Существуют микроскопные установки, составной частью конструкции которых является ГОЭ, созданные по принципам классической голографии [15]. Задачей ГОЭ в них является создание фантомного объекта сравнения. Данные установки позволяют проводить исследования трехмерной морфологии и фазовой структуры микроскопических объектов. Недостатком данного направления является сложность реализации и то, что обслуживание данной установки может осуществлять только высококвалифицированный персонал.

2. Цифровая микроскопия

Данное направление наиболее разработано, существуют промышленно выпускаемые микроскопы и профилометры, использующие этот принцип. Практически единственный, но очень существенный их недостаток — высокая стоимость.

3. Спекл-микроскопия

Как уже сказано выше, возможности ESPI-метода практически те же, что и для классической и цифровой голографий, а местами и превышают их. В то же время он значительно проще (а соответственно, дешевле) в практической реализации.

Ниже приведены данные, полученные при помощи спекл-микроскопа. [15]. Методы, положенные в основу его работы, частично запатентованы. В настоящее время в НИИ физики ОНУ ведутся работы по созданию ESPI-приставок к обычным оптическим микроскопам. Предполагается, что это позволит достичь практически таких же характеристик, как у специализированных устройств.

На рисунке 11 представлены результаты исследования 3D-формы тестового объекта — капли масла на поверхности предметного стекла.

Рисунок 11 – Микрофотография тестового объекта (капли масла на предметном стекле), её полный фазовый портрет, в котором распределение фаз представлено 255 изменениями красного цвета (черный – 0, ярко-красный - ), фазовый портрет, удобный для пользователя, в котором фазы разбиты на квадранты (синий – 0, желтый - , зеленый – , красный - ) и рассчитанная 3D-форма объекта.

На рисунке 12 представлены результаты по измерению 3D-формы эритроцита человека [16]. Важность этого исследования состоит в том, что степень вогнутости эритроцита коррелирует с его насыщением кислородом

Рисунок 12 – Микрофотография нормального эритроцита человека, его фазовый портрет и восстановленный по нему профиль изменения толщины.

Чрезвычайно полезно применение ESPI-микроскопа для определения состояния клеток, причем даже в живом состоянии, без какой-либо дополнительной обработки (окраски, фиксации). Важнейшей особенностью данных (фазочувствительных) методов является их чрезвычайно высокая чувствительность к изменению коэффициента преломления в исследуемых объектах. Это позволяет определять наличие цитоплазматических выбросов, тяжей, нарушений структуры мембраны и т.д. (рисунок 13).

Рисунок 13 – Микрофотография и фазовый портрет разрушенного моноцита. На фазовом портрете отчетливо видно, что внутренняя структура клетки и ее мембрана разрушена, слева вверху – цитоплазматический выброс.

Портативные голографические микроскопы

Методы современной электронной микроскопии позволяют ре-конструировать трехмерные изображения фазовых микрообъектов, но только специальным образом подготовленные (фиксация, металлизация и т. д.).

Для решения указанной задачи с использованием голографической техники встает вопрос о мобильности измерительной или диагностирующей аппаратуры. В большинстве случаев голографические установки представляют собой громоздкие виброзащищенные комплексы для проведения стационарных исследований.

Во ВНИИ оптико-физических измерений (ОФИ) проводились медико-биологические исследования живых нефиксированых эритроцитов. Целью исследований являлась разработка аппаратуры и методов лабораторной диагностики на основе лазерной техники и компьютерного анализа. Было показано, что метод количественной диагностики эритроцитов на основе голографической интерферометрии позволяет исследовать живые клетки крови без обработки одновременно по многим параметрам. Сравнительный анализ нового метода с традиционной световой и электронной микроскопией указал на дополнительные возможности микроинтерферометрии: количественная оценка поперечного сечения клетки, площади поверхности и объема эритроцита, сухого веса и концентрации гемоглобина. [28]

Интерференционный микроскоп в виде единого каркаса, на котором жестко закреплены все компоненты представлен на рисунке 14. Для регистрации голограмм использовались фотопластинки ПФГ-03. Источник излучения — гелий-неоновый лазер HRP050 с линейной поляризацией и выходной мощностью 5 мВт. Диаметр лазера 44.5 мм, длина 425 мм. В состав интерферометра входит биологический микроскоп. Голографический интерференционный комплекс состоит из оптического блока, источника излучения с блоком питания, регистратора голограмм, системы считывания и обработки информации. Оптический блок включает голографический интерферометр, систему микроскопа и электронную камеру. Оптический блок может работать в режиме голографической микроскопии и режиме телевизионной электронной спекл-интерферометрии.

Рисунок 14 – Конструкции голографического интерференционного микроскопа.

Голографирование изучаемой области проводится через объектив микроскопа, имеющий большую глубину резкости, чем весь микроскоп в целом, с помощью импульсного источника излучения либо с помощью скоростной кинокамеры при непрерывном излучении. Полученное объемное изображение рассматривается через окуляр микроскопа, который можно фокусировать на различные плоскости полученной объемной картины. Также создана специальная программа для быстрой обработки регистрируемых спекл-картин, (язык C++, среда Visial Studio 2005, библиотека MFC), которая позволяет сохранять результаты обработки и спектр интенсивности; разработан гибкий интерфейс. Входные данные могут быть представлены в любом графическом формате, поддерживаемом Windows. На рисунке 15 представлено рабочее окно программы с результатом обработки двух спекл-картин. В невозмущенном состоянии получена первая картина, вторая была зарегистрирована при введении газового потока перед рассеивателем, след от которого виден на рисунке.

Рисунок 15 – Результат обработки двух спекл-картин.

Компьютерная обработка результатов и построение изображений эритроцитов проводится с помощью программного пакета ORIGIN 4.0 при использовании режима усреднения матрицы.

Японские инженеры создали портативный голографический микроскоп, способный записывать трехмерные изображения с разрешением около 17 микрон. Устройство собрано из рекордно дешевых компонентов - их стоимость не превышает 250 долларов. Препринт работы выложен в архиве Корнельского университета, а его краткий обзор публикует блог Technology Review. [29]

Устройство представляет собой коробку (рисунок 16), легко умещающуюся на ладони. Внутри содержится веб-камера, точечная (пинхол) линза, а в качестве источника света выступает небольшой твердотельный лазер. Трехмерное изображение на основе данных веб-камеры восстанавливается в реальном времени на компьютере при помощи свободного ПО.

\

Рисунок 16 – Портативный голографический микроскоп с использованием веб-камеры.

Исследователи Калифорнийского университете в Лос-Анджелесе (University of California, Los Angeles, UCLA) разработали голографический микроскоп для недорогой диагностики кишечных заболеваний. Компактное устройство использует лазер вместо линз для определения болезнетворных бактерий в воде, пище или крови. [30]

Представленный учеными прототип весит всего 200 грамм, питается от двух батарей АА и имеет разрешение около 2 мкм (рисунок 17). Аналогичное увеличение обычно получают при помощи громоздких и сложных зеркально-линзовых микроскопов.

Рисунок 17 – Компактный голографический микроскоп без линз.

Как сообщает один из создателей микроскопа профессор Айдоган Озкан (Aydogan Ozcan), устройство может работать в двух режимах: «передача», для анализа жидкостей, и «отражение», при котором исследуются твердые и непрозрачные материалы. Луч лазера разделяется зеркалом на два пучка, один из которых подсвечивает образец, а отраженную «картинку» фиксируют на КМОП-сенсор. После математической обработки изображения исследователи получают фактически 3D-изображение образца. Ключевым преимуществом микроскопа создатели отмечают его чрезвычайно низкую стоимость. При цене $5 за полупроводниковый лазер и $15 за сенсор суммарная стоимость микроскопа не превысит $100 с учетом модулей для передачи данных на компьютер или в Интернет.

4. Ультразвуковая голография

С помощью голографии успешно решается проблема визуализации акустических полей. Это имеет большое прикладное значение. Возможные применения звуковой голографии – дефектоскопия, изучение рельефа морского дня, звуколокация, звуконавигация, поиск полезных ископаемых, исследование структуры земной коры и т.д.