Электрофорез белков в полиакриламидном геле

  
 
Электрофорез белков в полиакриламидном геле  
 

 

Презентацию подготовили студентки 1 курса, стоматологического факультета, 10 группы Хворостинина Тамара, Статкевич Наталья, Федорович Евгения.

 

Архангельск, 2013.

 

 

 

Министерство  здравоохранения РФ 
Северный государственный медицинский университет

Кафедра общей и биоорганической химии

  

 

Электрофорез  белков в полиакриламидном геле — метод разделения смесей белков в полиакриламидном геле в соответствии с их электрофоретической подвижностью (функцией длины полипептидной цепочки или молекулярной массы, а также укладки белковой молекулы, посттрансляционных модификаций и других факторов). Данный способ фракционирования белков и пептидов широко применяют в современной молекулярной биологии, биохимии, генетике

• Разработано большое количество модификаций электрофореза белков в полиакриламидном геле для решения разных задач и для различных белков и пептидов.

 

• Наиболее распространённой разновидностью является электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия по Лэммли (англ. SDS PAGE).

• Электрофоретическая подвижность биополимеров в геле зависит от ряда параметров.
• Скорость миграции пропорциональна заряду молекулы, и в свободной жидкости молекулы с одинаковым удельным зарядом мигрируют с равной скоростью.
• В случае разделения в среде, имеющей жесткую пространственную матрицу, происходит сегрегация за счет трения о гель. Сила трения зависит от пространственной конфигурации молекулы, в том числе от её размера. Таким образом, в случае электрофоретического разделения нативных белков будет наблюдаться сложная картина их распределения в зависимости от вышеприведенных факторов

 

Механизм  разделения

• В 1970 году Лэммли для изучения процесса сборки капсида бактериофага Т4 предложил метод электрофоретического разделения белков в полиакриламидном геле в зависимости от молекулярной массы.
• Для этого перед нанесением на гель образцы кипятили в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) и 2-меркаптоэтанола.
• Под воздействием 2-меркаптоэтанола происходит восстановление дисульфидных связей, что предотвращает выпетливание денатурированных полипептидов и повышение их подвижности. SDS является сильным детергентом, его молекула состоит из двенадцатичленной алифатической неразветвленной цепи и ковалентно связанного с ним сульфата, имеющего в растворе отрицательный заряд

 

 

SDS-PAGE по  Лэммли

При использовании описываемого метода ученые исходят из следующих  положений:

• белки после обработки SDS (Sodium dodecyl sulfate) находятся в полностью денатурированном состоянии;
• количество молекул SDS, связанных с полипептидом, пропорционально его длине, и, следовательно, молекулярной массе;
• собственный заряд полипептида несущественен в сравнении с зарядом связанного с ним SDS.

 

В данных условиях, все полипептиды имеют одинаковый удельный заряд и разделяются  обратно пропорционально логарифму  их молекулярной массы. Практика подтверждает верность данных предположений в  подавляющем большинстве случаев.

• Для проведения денатурирующего электрофореза в ПААГ используются различные буферные системы. Наиболее распространённая система, которая подразумевается по умолчанию — это буферная система Лэммли. Кроме того, в подавляющем числе работ используют, так называемый, disc-электрофорез (от англ. discontinous — разрывный) то есть используют гель, состоящий из двух частей. Концентрирующий гель имеет pH 6,8 и концентрацию полиакриламида от 2 до 8 %. Разделяющий гель имеет рН в районе 8,5-9 и концентрацию полиакриламида от 5 до 20 %.

 

• Выбор плотности геля зависит от молекулярных масс исследуемых белков. Все буферы не содержат неорганических солей, основным переносчиком тока в них является глицин.

 

• При рН 6,8 суммарный заряд молекулы глицина близок к нулю. Вследствие этого для переноса определенного заряда (который определяется силой тока в электрофоретической ячейке), отрицательно заряженные комплексы полипептидов с SDS должны двигаться с большой скоростью.
• При рН 8,8 глицин приобретает отрицательный заряд, вследствие чего на границе концентрирующего и разделяющего гелей белки резко тормозятся (в переносе одинакового заряда через единицу площади теперь участвует гораздо больше заряженных молекул, следовательно, они двигаются с меньшей скоростью). Результатом этого является концентрирование белков на границе гелей, что очень сильно повышает разрешающую способность метода.

 

Для визуализации результатов  электрофореза чаще всего используют окрашивание белков в гелях красителем Кумасси или серебром. Для проведения данного окрашивания белки переносят из геля на нитроцеллюлозную мембрану

 

 

Визуализация  продуктов разделения.  

• Денситометр является сканером, который относится к контрольно-измерительным приборам и подлежит поверке с целью определения и подтверждения соответствия характеристик средства измерения установленным требованиям.

 

• Оцифрованное изображение геля обрабатывают при помощи специализированного программного обеспечения, которое позволяет достоверно определить такие параметры как электрофоретическая подвижность белка, его чистота, количество белка в пятне и др.

 

Интерпретация результатов.

• …предполагает построения зависимости относительной электрофоретической подвижности (Rf) каждого из маркерных белков от десятичного логарифма их молекулярной массы. Обычно зависимость имеет вид сигмообразной кривой.

 

• Достоверными результаты считаются, в случае если длина пробега белков-маркеров составляет не менее 80% длины разделяющего геля, а зависимость их Rf от логарифма молекулярной массы является линейной (R²> 0,95). Т.е. для расчетов используют лишь тот участок калибровочной кривой, который покрывает электрофоретическую подвижность исследуемого белка.

 

Определение молекулярной массы исследуемого белка…

• Фотография полиакриламидного геля, иллюстрирующая разделение белков по молекулярной массе.

 

• Маркеры на левой дорожке

http://dic.academic.ru

http://www.ngpedia.ru

 

Список  источников: