Лабораторные методы диагностики менингита

СОДЕРЖАНИЕ

 

Введение……………………………………………………………………………...3

Основная часть

1. Энтеровирусный серозно-вирусный менингит. История, понятия, классификация………………………………………………………………...4
2. Общие принципы лабораторной диагностики……………………………...8
3. Методы лабораторной диагностики серозно-вирусного менингита………9

Заключение………………………………………………………………………….14

Литература……………………………………………………………………..……15

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ВВЕДЕНИЕ

Во всем мире менингиты продолжают оставаться одной из самых распространенных форм поражения центральной нервной  системы, как у взрослых, так и  у детей. В течение последних  лет в России, как и в других странах мира, возросло количество пациентов, в первую очередь детей, с вирусными (серозными) менингитами. В настоящее время частота  встречаемости вирусных менингитов значительно превышает частоту  встречаемости гнойных поражений  мозговых оболочек. Среди многочисленных вирусных менингитов особое значение имеет серозный менингит энтеровирусной этиологии (СМЭЭ), эпидемические подъемы  заболеваемости которым наблюдаются  в нашей стране в течение последних  лет. Несмотря на преимущественно благоприятное  течение, в ряде случаев это заболевание  может протекать тяжело, приводить  к летальным исходам.

Применение лабораторных методов  исследования является одним из ключевых аспектов диагностики и лечения  данных заболеваний. Без данных лабораторных анализов невозможна не только постановка клинического диагноза, но и контроль за эффективностью и безопасностью лекарственной терапии.

В настоящее время в арсенале специалистов есть разнообразные методы лабораторной диагностики, как классические, так и новейшие, появившиеся в последние десятилетия и нашедшие широкое применение в практике [1, 4].

 

 

 

 

 

 

 

1. ЭНТЕРОВИРУСНЫЙ СЕРОЗНО-ВИРУСНЫЙ МЕНИНГИТ.  ИСТОРИЯ, ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ, КЛАССИФИКАЦИЯ

 

Менинги́т  (термин состоит из др.-греч. μῆνιγξ — «мозговая оболочка» и суффикса лат. -itis - обозначающий воспалительный процесс) — воспаление оболочек головного мозга и спинного мозга (Рис. 1).

 

 

Рисунок 1 – Пример процесса воспаления мозговых оболочек

Единой общепринятой классификации менингитов нет, однако большинство исследователей предлагают классифицировать менингиты по критериям, представленным в таблице 1.

В общей структуре инфекционных менингитов подавляющее число случаев  составляют менингиты вирусного  происхождения. Энтеровирусные серозные менингиты составляют 85-90% от общего числа случаев менингитов вирусной этиологии.

 

Таблица 1. Классификация  менингитов, в зависимости от критериев [8].

По возникновению
первичные  возникают без предшествующей инфекции или локального процесса	вторичные  являются осложнением основного заболевания
По этиологии
Бактериальные	Вирусные	Гельминтные
Грибковые	Спирохетозные	Сочетанные
Риккетсиозные	Протозойные
По характеру  воспалительного процесса и изменениям в цереброспинальной жидкости
Серозные	Гнойные
По длительности течения
Острые	Затяжные	Хронические
По тяжести
Легкие	Среднетяжелые	Тяжелые

 

Серозный менингит является наиболее распространенной формой энтеровирусного  поражения ЦНС (центральной нервной системы). Оно часто не ограничивается воспалением менингеальных оболочек. Процесс может параллельно (или преимущественно) затрагивать и собственно вещество (паренхиму) головного мозга и спинной мозг.

Вызывается EСНО (Enteric Cytopathic Human Orphan)-вирусами 6,9,7,30,32,33,1-11,18-22 серотипов, энтеровирусом 71 серотипа, Коксаки В3, А7, 14,2,9,10 вирусами. Общие эпидемиологические особенности: высокая контагиозность; весенне-летняя сезонность с пиком заболеваемости в июне-августе; массовость заболевания, причем 70-80% заболевших составляют дети 5-9 лет.

Источник инфекции – больной  человек и здоровый вирусоноситель. Основной механизм  распространения  – аэрогенный (воздушно-капельный), но возможна и фекально-оральная передача возбудителя [8].

Инкубационный период при  энтеровирусных серозных менингитах составляет в среднем около 1 недели. Серозный менингит сопровождается лихорадкой, головными болями, фотофобией и менингеальными симптомами [6]. Менингеальный синдром протекает обычно доброкачественно с улучшением в течение нескольких дней. Смертельные исходы редки.

Начало изучению серозного  менингита положил Г. Квинке методом прижизненного исследования цереброспинальной жидкости (1893). Вскоре Бенингхаус (С. Boninghaus, 1897) установил существование особой формы болезни — острого серозного менингита. Некоторые авторы, в том числе и Г. Квинке, отождествляли серозный менингит с «головной водянкой» и всякое увеличение цереброспинальной жидкости, даже без изменения её состава, трактовали как серозный менингит.  В дальнейшем французские авторы стали отличать истинный серозный менингит, сопровождающийся воспалительными изменениями мозговых оболочек, от их раздражения на почве интоксикации организма или под воздействием других факторов и ввели термин «менингизм». Большинство немецких клиницистов высказывались против разграничения этих понятий, считая, что токсическое раздражение мозговых оболочек вначале вызывает явления менингизма, а при более резком раздражении — серозное воспаление. В начале 20 века взгляд на серозный менингит изменился. Л. О. Даркшевич (1909) выделил в серозном менингите первичный, являющийся самостоятельным инфекционным заболеванием, и вторичный, который может возникнуть при любой инфекции, интоксикации или травме.

Валльгрен (A. J. Wallgren) в работе «Новое инфекционное заболевание центральной нервной системы» описал в 1925 году эпидемическую вспышку острого серозного менингита, названного им «асептический серозный менингит». Позднее была доказана роль энтеровирусов Коксаки и ECHO в этиологии серозного менингита. Энтеровирусная инфекция получила распространение практически во всех частях земного шара. Первые сведения об эпидемиях энтеровирусного менингита, имеющие вирусологическое подтверждение, получены в 1954 году США. В Европе (Швеция) с 1954 год официально зарегистрировано учащение случаев эпидемического серозного менингита.  Особенно большое распространение энтеровирусная инфекция получила в летне-осенние месяцы в 50-е годы в Англии, Бельгии, Нидерландах, Швеции, Норвегии, Америке [6].

На протяжении 70 - 90-х годов большое  внимание привлек энтеровирус 71 – новый серотип рода энтеровирусов. Энтеровирус 71 вызвал вспышки нейроинфекции в США, Австралии, Швеции, Японии (1969 - 1973), Болгарии (1975), Венгрии (1976), Малайзии (1997), Тайване (1998), Сингапуре (1999)[6]. Возбудителями энтеровирусного менингита в России, странах Европы, США и Японии в последние 10 - 20 лет наиболее часто были вирусы ЕСНО 30, ЕСНО 11.

В России на территории Хабаровского края заболеваемость энтеровирусной инфекцией регистрируется с 1956 года. При этом отмечаются периодические подъемы и спады заболеваемости с периодичностью в 5-7 лет. Максимальный подъем заболеваемости зарегистрирован в 1978 году (140,0 на 100000 населения). С 1975 года отмечено 10 эпидемических подъемов, заболеваемости серозно-вирусным менингитом. Возникновение значительных сезонных подъемов серозно-вирусного менингита, было, как правило, связано с появлением нового, ранее не встречавшегося, или давно не циркулировавшего на территории края серотипа энтеровируса.  Можно предположить, что такая смена происходит в результате формирования у восприимчивого населения коллективного иммунитета к определенному серотипу энтеровируса и появления в популяции лиц, неиммунных к новым энтеровирусам [5].

 

 

 

 

 

 

2. ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ

В лабораторной диагностике вирусных инфекций имеются три основных подхода:

1) непосредственное исследование материала на наличие вирусного антигена или нуклеиновых кислот;

2) изоляция и идентификация вируса из клинического материала;

3) серологическая диагностика, основанная на установлении значительного прироста вирусных антител в течение болезни.

При любом выбранном подходе  к вирусной диагностике одним  из важнейших факторов является качество исследуемого материала. Так, например, для прямого анализа образца  или для изоляции вируса исследуемый  материал должен быть получен в самом  начале заболевания, когда возбудитель  еще экскретируется в относительно больших количествах и не связан пока антителами, а объем образца должен быть достаточен для проведения прямого исследования. Также важен выбор материала в соответствии с предполагаемым заболеванием, то есть того материала, в котором исходя из патогенеза инфекции вероятность присутствия вируса наибольшая.

Не последнюю роль в успешной диагностике играет среда, в какую  берется материал, как он транспортируется и как хранится. Так, носоглоточные  или ректальные мазки, содержимое везикул  помещают в среду, содержащую белок, предотвращающий быструю потерю инфекционности вируса (если планируется его изоляция), или в соответствующий буфер (если планируется работа с нуклеиновыми кислотами) [7].

Решающую роль в диагностике и лечении инфекционных болезней играет определение возбудителя. Обнаружить возбудитель в организме больного можно путем непосредственной микроскопии, бактериологического посева, биологической пробы на животных, вирусологических, серологических методов исследования и ДНК-диагностики [2].

 

3. МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ СЕРОЗНО-ВИРУСНОГО МЕНИНГИТА

 

Серозные менингиты диагностируются  несколькими методами.  

Специфические методы: вирусологический – выделение вируса на культуре клеток с последующей идентификацией типовой принадлежности в РН; вирусоскопический – обнаружение вируса в материале при помощи электронной микроскопии; экспресс методы – обнаружение в материале (кровь, ликвор, фекалии) вирусспецифических антигенов с помощью ИФА, фрагментов нуклеиновых кислот вирусов в ПЦР; серологический – определение нарастания титра специфических противовирусных антител в 4 раза и более в парных пробах крови и ликвора, взятых в первые дни болезни и повторно через 2-3 нед.

Неспецифические методы: люмбальная пункция – цереброспинальная жидкость прозрачная, бесцветная, вытекает частыми каплями или струей. Отмечается умеренный плеоцитоз до 300-500 кл. в 1 мкл, который в начальном периоде может быть смешанным (с наличием нейтрофилов и макрофагов), в периоде разгара – лимфоцитарным. Содержание белка в ликворе умеренно повышено (0,6-1,0 г/л); в клиническом анализе крови отмечается умеренный лейкоцитоз с лимфоцитозом, СОЭ повышена.

Специфические методы делятся на прямые и непрямые.

Прямые методы – это методы, которые позволяют обнаружить вирус, вирусный антиген или вирусную нуклеиновую кислоту (НК) непосредственно в клиническом материале, то есть являются наиболее быстрыми (2–24 ч). Однако из-за ряда особенностей возбудителей прямые методы имеют свои ограничения (возможность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов). Поэтому они часто требуют подтверждения непрямыми методами.

Электронная микроскопия (ЭМ). С помощью этого метода можно обнаружить собственно вирус. Для успешного определения вируса его концентрация в пробе должна быть примерно 1·10⁶ частиц в 1 мл. Но поскольку концентрация возбудителя, как правило, в материале от больных незначительна, то поиск вируса затруднен и требует предварительного его осаждения с помощью высокоскоростного центрифугирования с последующим негативным контрастированием. Кроме того, ЭМ не позволяет типировать вирусы, так как у многих из них нет морфологических различий внутри семейства.

Одним из вариантов ЭМ, используемым в диагностических целях, является иммунная электронная микроскопия (ИЭМ), при которой применяются специфические антитела к вирусам. В результате взаимодействия антител с вирусами образуются комплексы, которые после негативного контрастирования легче обнаруживаются. ИЭМ несколько более чувствительна, чем ЭМ, и используется в тех случаях, когда вирус не удается культивировать in vitro.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ). Метод основан на использовании антител, связанных с красителем, например флюоресцеинизотиоцианатом. РИФ широко применяется для выявления вирусных антигенов в материале больных и для быстрой диагностики.

В практике применяются два варианта РИФ: прямой и непрямой. В первом случае применяются меченные красителем антитела к вирусам, которые наносятся на инфицированные клетки (мазок, культура клеток). Таким образом, реакция протекает одноэтапно. Неудобством метода является необходимость иметь большой набор конъюгированных специфических сывороток ко многим вирусам. При непрямом варианте РИФ на исследуемый материал наносится специфическая сыворотка, антитела которой связываются с вирусным антигеном, находящимся в материале, а затем наслаивается антивидовая сыворотка к гамма-глобулинам, в котором готовилась специфическая иммунная сыворотка. Преимущество непрямого варианта РИФ состоит в потребности лишь одного вида меченых антител.