Методы клеточной инженерии применительно к животным клеткам

10. Методы клеточной  инженерии применительно к животным  клеткам. Гибридомная технология и ее использование в биотехнологических процессах.    

Накоплен большой опыт культивирования соматических клеток животных in vitro, разработаны оптимальные среды и режимы культивирования, отработаны способы длительного хранения клеток при низких температурах.         

На первом месте - метод разделения ранних эмбрионов. Первый успешный опыт по разделению эмбрионов на стадии 2—8 бластомеров был осуществлен Виллардом. Но получение такого материала связано с большими трудностями. 
 
В результате исследователи начали манипулировать с эмбрионами в более поздних стадиях развития (морула, бластоциста). Сущность метода: предварительно вскрывается прозрачная зона, эмбрион разделяется на две части. При этом одна половина остается в прежней зоне, а другую переносят в заранее подготовленную зону и производят обычную трансплантацию. Во многих опытах приживляемость разделенных эмбрионов достигает 50—60%. Стало очевидным, что разделение эмбрионов — эффективный метод увеличения потомства. 
 
Возможность массового получения идентичных генетических копий очень важна. Эти животные имеют большую ценность для исследователей, занимающихся проблемой взаимодействия генотипа и среды. Использование идентичных двоен позволяет повысить точность исследований и достичь достоверных результатов при меньшем числе подопытных.

Гибридомная технология. Слияние клеток растений, растущих в культуре обычно медленно, с клетками растительных опухолей позволяет получить клоны быстрорастущих клеток — продуцентов нужных соединений. Многообразно применение гибридомной технологии к животным клеткам, где с ее помощью планируется получение неограниченно размножающихся продуцентов гормонов и белковых факторов крови. Наибольшее практическое значение имеют гибридомы — продукты слияния клеток злокачественных опухолей иммунной системы с лимфоцитами.

При попадании в организм животного или человека чужеродного агента — бактерий, вирусов, «чужих» клеток или просто сложных органических соединений — лимфоциты мобилизуются для обезвреживания введенного агента. Слияние Т-лимфоцита-киллера (атакуют чужеродный агент) с опухолевой клеткой дает клон неограниченно размножающихся клеток, выслеживающих определенный антиген — тот, к которому был специфичен взятый Т-лимфоцит.

При слиянии В-лимфоцита (продуцируют Ig-антитела) с миеломной клеткой получаются В-гибридомные клоны, применяемые как продуценты моноклональных антител, нацеленных на тот же антиген. Моноклональные антитела однородны по свойствам, они обладают одинаковым сродством к антигену и связываются с одной антигенной детерминантой, инактивируя антиген.

Освоение технологии получения гибридом на основе иммунных клеток человека связано с трудностями: человеческие гибридомы растут медленно, мало стабильны. Но уже получены гибридомы человека — продуценты моноклональных антител. Оказалось, что и человеческие моноклональные антитела могут вызывать иммунные реакции, и их клиническая эффективность зависит от правильного подбора класса антител, гибридомных линий, подходящих для данного больного. Достоинства: способность распознавать тонкие различия в структуре антигена, которые не распознаются моноклональными антителами крысы.

Недостатки: не стабильны при хранении в высушенном состоянии, низкое сродство к антигену и узкая специфичность, что препятствует их применению против изменчивых антигенов (инфекционные агенты и опухолевые клетки, высокая стоимость.

44. Биотехнология  аминокислот. Преим-ва микробиологич синтеза перед другими методами получения. Общие принципы конструирования штаммов м/о- продуцентов а/к как первичных метаболитов.

Аминокислоты — главный строительный материал организма, из которого формируютея пептиды и белки.

Получение а/к возможно несколькими путями: химическим синтезом, гидролизом природного белкового сырья и в биотехнологических процессах. Химический синтез дает рацемат - продукт, содержащий L-, так и D-формы а/к. Кроме глицина (не имеет оптически активных изомеров), и метионина (усваивается в обеих формах), D-изомеры токсичны. Получение оптически активных L-изомеров а/к из гидролизатов природных материалов растительного и животного происхождения связано с многоступенчатой и дорогостоящей очисткой. Биотехнологическое получение аминокислот включает в себя прямую микробную ферментацию, а также микробиологический или ферментативный синтез из предшественников.

Микробиологический метод получения а/к основан на способности м/о синтезировать все L-аминокислоты, а в опр-х условиях - обеспечивать их сверхсинтез (1 схема).

Биосинтез а/к в микробных клетках протекает в виде свободных а/к или «пула аминокислот», из которого в процессах конструктивного метаболизма синтезируются клеточные макромолекулы. Для синтеза всех белков требуется 20 аминокислот. Пути синтеза больш-ва а/к взаимосвязаны: пируват - предшественник аланина, валина, лейцина; 3-фосфоглицерат - серина, глицина, цистеина и т.д. Синтез каждой а/к в микробных клетках реализуется в строго опр-х кол-х, обеспечивающих образование последующих а/к, и находится под генетическим контролем. Контроль осущ-ся по принципу обратной связи на уровне генов, ответственных за синтез соот-х ферментов (репрессия), и на уровне самих ферментов, которые в результате избытка образующихся а/к могут изменять свою активность (ретроингибирование). Данный механизм контроля исключает перепроизводство а/к и также препятствует их выделению из клеток в окружающую среду. Чтобы добиться сверхсинтеза отдельных аминокислот, нужно изменить данный контрольный механизм их синтеза. Для первого пути возможно использование природных «диких» штаммов; очень существенны при этом условия ферментации, так как добиться дисбаланса в системе синтеза аминокислот можно путем изменения ряда основных факторов среды (концентрация основного субстрата, рН, соотношение макро- и микроэлементов в среде и др.). Изменение контрольного механизма синтеза аминокислот осуществляется генетическими методами. При этом получают мутантные организмы: ауксотрофные и регуляторные мутанты.

Среди продуцентов аминокислот - различные м/о, представители родов Corynebacterium, Bacillus, Aerobacter, Microbacterium, Eschirichia.

74. Биополимеры, характеристика, микробиологический метод получения. Перспективы практического применения.

Биополимеры- высокомолекулярные соединения, синтезир-е живыми орг-ми.Нек-е из них облад ценными физ-хим св-ми и могут исп-ся в пищев, перерабатыв-й и фарм промышл-ти.

Микробиологический синтез каучука

Натуральный каучук- это широко используемый биополимер, который получают из различных растений. Его биосинтез начинается с превращения простых сахаров и включает 17 ферментативных реакций. В ходе последней из них происходит полимеризация изопентилпирофосфата с образованием аллилпирофосфата.

Ввиду большой коммерческой ценности каучука были проведены исследования, направленные на то, чтобы выяснить, можно ли использовать для его получения рекомбинантные микроорганизмы. Прежде всего с помощью мРНК из растения Гивея бразильская, синтезирующего каучук, была создана соответствующая кДНК-библиотека. Затем проведена гибридизация, исходя из данных об а/к последовательности одного из участков молекулы полимеразы каучука. Для того чтобы доказать, что клонированная кДНК действительно кодирует этот фермент, использовали антитела к очищенному ферменту. Теперь, используя этот клон кДНК и другие гены биосинтеза каучука, можно синтезировать натуральный каучук микробиологическими методами. С другой стороны, с помощью этой кДНК можно также получить полимеразу каучука и создать каталитическую сиситему in vitro.

Микробиологический синтез полигидроксилааканоатов Полигидроксиалканоаты — это биодеградируемые полимеры,синтезируемые множеством м/ов (прежде всего Akaligenes eutrophus) и использующиеся ими как внутриклеточный источник углерода и энергии. Они обладают разными свойствами в зависимости от состава и могут применяться для получения биодеградируемых пластмасс, используемых для изготовления упаковочного материала.

 Однако этот м/о растет  медленно и использует лишь ограниченное число источников углерода, что делает производство дорогим. Можно использовать другой путь: при перенесении генов биосинтеза этого полимера в Е. coil получаются быстрорастущие трансформанты, накапливающие в большом кол-ве. Поли(3-гид-роксимасляная кислота) синтезируется из ацетил- СоА в 3 стадии, катализируемые тремя равными ферментами. Оперон, содержащий эти гены, встроен в плазмиду, но при росте в отсутствие антибиотиков, половина клеток Е. соli теряла данную плазмиду уже после 50 генераций. Это не очень существенно, когда масштабы культивирования малы, но становится проблемой при крупномасштабной ферментации. Чтобы обойти эту трудность, в плазмиду, несущую оперон поли(3-гидроксимасляной кислоты), встроили локус из другой плазмиды, который обеспечивает стабилизацию плазмид. Еще одно преимущество синтеза поли(3-гидроксимасляной кислоты) в E.coli в том, что когда ее экстрагируют щелочным раствором хлорноватистокислого натрия (калия), то она разлагается меньше.

Поли(3-гидроксибутират-со-3-гидроксива-лерат) аналогичен по своим свойствам полипропилену, так что получение его микробиологическими методами представляеть коммерческий интерес.