Методы культивирования вирусов

Инокулированные в культиватор клетки прикрепляются к поверхности частиц МН и размножаясь, образуют сплошной монослой на каждой отдельной частице.

Основными преимуществами этого  метода являются:

1) создание равномерных  условий по всему объему сосуда, что делает возможным эффективно контролировать необходимые параметры (рН, р0₂ и др.); 2) получение высокой плотности клеточной популяции до 5-6 млн. клеток в 1 мл; 3) культивирование одновременно несколько сот миллиардов клеток; 4) введение постоянного контроля за динамикой роста клеток; 5) снижение роста контаминации в связи с сокращением операций, связанных с разгерметизацией культураль-ного сосуда; 6) значительная экономии питательных сред; 7) возможность сохранять выросшие клетки непосредственно на частицах при низких температурах; 8) возможность искусственно создавать различные концентрации МН с выросшими на них клетками; 9) возможность пассирования культуры без применения трипсина путем добавления свежих порций микроносителя.

Микроносители должны иметь:

- небольшой положительный  заряд в пределах 1,5-1,8 МЭКВ/г. В  связи с тем, что большинство  клеток животных имеют слабо  отрицательный заряд, они легче будут прикрепляться к такому МН:

- плотность 1,05—1,15 г/см; указанная  плотность является оптимальной для поддержания МН во взвешенном состоянии;

- диаметр частиц от 100 до 250 мкм, что обеспечивает площади  для роста нескольких сотен  клеток;

- гладкую поверхность;

- прозрачность;

- отсутствие токсичности  компонентов для клеток;

- незначительное впитывание  компонентов среды;

- универсальность, обеспечивающую  возможность использования их  для первичных, диплоидных и  гетероплоидных клеток. Немаловажное значение имеют свойства МН, которые позволяют использовать их многократно.

Проведено исследование многих гранулированных препаратов различной химической природы, в том числе из поперечно-сшитого (ПС) декстрана, ПС-агарозы, ПС-поливинилпиролидона, полиакрилнитрита, пористого селикагеля, полистирола, капрона, нейлона, алюмосиликата с целью использования их как микроносителей.

Пригодными являются только некоторые из них, главным образом  имеющие в своей основе ПС-декстран.

Несколько зарубежных фирм разработали коммерческие препараты  микроносителей, готовые к употреблению: Цитодекс-1, 2, 3 (Франция, Швеция), Супербит (США, Англия), Биосилон (Дания). Стоимость перечисленных препаратов довольно высока, поэтому необходимо проводить исследования по разработке и производству отечественных МН.

Культивирование клеток на микроносителях проводят в обычных ферментерах для суспензионного культивирования. В ферментере не должно быть каких-либо выступов, карманов, чтобы предотвратить накопление микроносителей в застойных зонах. Поэтому разумно использовать ферментеры с круглым дном и гладкими стенками. Внутренняя поверхность ферментера должна быть силиконизирована для предотвращения прилипания микроносителей к стеклу или нержавеющей стали ферментера.

Для контроля за окружающими  культуру условиями такими, как рН и О₂, может быть использовано стандартное оборудование. Скорость перемешивания суспензии с носителем должна быть 40-60 об/мин. Для выращивания на МН применяются различные типы клеток.

Концентрация цитодекса может варьировать от 0,5 до 5 мг/мл. Однако, при производстве профилактических вакцин, применяют обычно конечную концентрацию цитодекса, не превышающую 1 мг/мл. Повышение концентрации до 3 мг/мл и выше создает дополнительные трудности, связанные с необходимостью перфузии питательной среды и частичной ее замены, что осложняет технологический процесс.

Посевная концентрация клеток, а также условия культивирования  на МН в первые часы в значительной степени определяют оптимальные  параметры для пролиферации и максимального накопления клеток. Показано, что посев 10 клеток/мл перевиваемой линии почек обезьян (Vero) и диплоидных клеток фибробластов эмбриона человека (MRC-5) в уменьшенном до 1/3 объема питательной среды и при периодическом включении мешалки (30 об/мин) на одну минуту через каждый час в течение 4 часов, с последующим добавлением питательной среды до конечного объема, ведет к увеличению пролиферации клеток и их количества по сравнению с контролем (полный объем питательной среды в момент посадки клеток и непрерывная работа мешалки с начала культивирования).

Важное значение для культивирования  клеток на МН имеет питательная среда. Правильный подбор питательной среды  также будет способствовать оптимизации процесса пролиферации клеток и их качество. Необходимо проводить подбор питательных сред для культивирования клеток на различных типах МН. Показано, что перевиваемая линия клеток почек обезьян (Vero) на цитодексе дает наибольший выход при использовании среды Игла ДМЕ (посадочная концентрация клеток 10⁵ мл) но сравнению со средой ВМЕ и 199. Если же количество клеток при посадке снизить до 10⁴, то лучшие результаты дает среда 199. Все испытуемые среды содержали 10% фетальной сыворотки.

3.6. Культивирование вирусов  на куриных эмбрионах

Куриный эмбрион - куриный  зародыш, находящийся на разных  стадиях эмбрионального развития. В микробиологической практике  используют для выделения, культивирования  и идентификации вирусов, риккетсий  и иногда бактерий. Для лабораторных  целей отбирают свежие, оплодотворенные, с хорошо просвечивающей и не имеющей трещин скорлупой КЭ. Инкубацию проводят в гнездах штатива тупым концом яйца вверх в хорошо вентилируемых инкубаторах или термостатах при 37 -37,5 °С, относительной влажности 63-65%. Для заражения отбирают 4- 13-дневные эмбрионы с выраженными кровеносными сосудами, желточным мешком и подвижной тенью. Перед заражением скорлупу яиц обрабатывают спиртом, обжигают и в области введения (чаще над воздушной камерой) смазывают 2% йодной настойкой. Материал или исследуемую культуру вводят, вскрывая или не вскрывая скорлупу, в желточный мешок (риккетсий), в аллантоисную или амниотическую полости (большинство вирусов), наносят на хорион-аллантоисную оболочку. Реже культуру вводят в тело эмбриона или в/в. Зараженные КЭ помещают в термостат в условиях и на сроки, которые зависят от вида микроба и целей исследования. Некоторые данные о результатах заражения можно получить при внешнем осмотре КЭ под микроскопом (инъекция сосудов, потеря подвижности и др.). Однако в большинстве случаев КЭ вскрывают. Для этого после обработки спиртом и йодной настойкой скорлупу срезают выше границы воздушного мешка, пастеровской пипеткой или шприцем отсасывают сначала аллантоисную, а затем амниотическую жидкость, избегая повреждения сосудов и желточного мешка. Эмбрион и хорионаллантоисную оболочку извлекают из скорлупы, помещают в стерильные чашки, промывают стерильной дистиллированной водой и осматривают. Дальнейший ход исследования эмбриона и его жидкостей зависит от вида микроба или вируса и целей опыта. 

3.7. Культивирование вирусов  на лабораторных животных

Вирусы культивируют на биологических  моделях - в организме лабораторных животных. Лабораторных животных (взрослых и новорожденных белых мышей, хомяков, кроликов, обезьян и др.) заражают исследуемым вируссодержащим  материалом различными способами. Индикацию, т.е. обнаружение факта размножения  вирусов, устанавливают на основании  развития типичных признаков заболевания, патоморфологических изменений  органов и тканей животных или  положительной реакции гемагглютинации (РГА). РГА основана на способности  некоторых вирусов вызывать агглютинацию (склеивание) эритроцитов различных  видов животных, птиц и человека за счет имеющегося на поверхности  вириона особого белка гемагглютинина. Реакцию проводят вне организма  — в пробирках (in vitro), по сути она не является иммунологической реакцией. Использование животных для культивирования вирусов в диагностических целях в настоящее время весьма ограничено.

Видовая чувствительность животных к определенному вирусу и их возраст  определяют репродуктивную способность  вирусов. Во многих случаях только новорожденные  животные чувствительны к тому или  иному вирусу (например, мыши-сосунки  — к вирусам Коксаки).  
Преимущество данного метода перед другими состоит в возможности выделения тех вирусов, которые плохо репродуцируются в культуре или эмбрионе. К его недостаткам относятся контаминация организма подопытных животных посторонними вирусами и микоплазмами, а также необходимость последующего заражения культуры клеток для получения чистой линии данного вируса, что удлиняет сроки исследования.   
  
  
 

Список литературы

1. Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков. - М.: Мир, 1983, 263 с.
2. Вирусология. Методы. / Под ред. Б. Мейхи. - М.: Мир, 1988, 344 с.
3. Голубев Д. Б., Соминина А. А., Медведева М. Н. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. - Л.: Медицина, 1976.
4. Дьяконов Л. П., Глухов В. Ф., Поздняков А. А., Денисенко Г. Ф., Калмыкова Т. П. Культивирование клеток и тканей животных. - Ставрополь: Ставроп. Правда, 1988, 2 часть, 91 с.
5. Животная клетка в культуре  под. ред. Л. П. Дьяконова, В. И. Ситькова. – М.: 2000
6. Культура животных клеток. Методы. / Под ред. Р. Фрешни. - М.: Мир, 1989, 333 с.
7. Руководство по ветеринарной вирусологии. / Под ред. В. Н. Сюрина. - М.: Колос, 1965, 687 с.
8. Сергеев В. А. Репродукция и выращивание вирусов животных. - М.: Колос, 1976, 303 с.
9. Феннер Ф., Мак-Ослен Б., Мимс С., Сэмбрук Дж., Уайт Д. Биология вирусов животных. - М.: Мир, 1977, т. 1, 447 с.