Пересадка Эмбрионов у КРС

Введение.

Биотехнология в воспроизводстве  и селекции крупного рогатого скота  имеет особое значение. Крупный рогатый  скот относится к одноплодным  видам млекопитающих. Поэтому от одной коровы можно получить в  лучшем случае одного теленка в год, в то время, как в её яичнике содержатся сотни тысяч незрелых половых клеток (ооцитов), представляющих огромный генетический резерв. Кардинальное решение проблемы ускоренного воспроизводства скота состоит в том, чтобы перейти к нетрадиционным способам увеличения плодовитости. Для этого применяется целый ряд биотехнических методов, разработанных на основе углубленных исследований репродуктивной функции, её регуляции, а также на совершенствовании приемов манипуляции с эмбрионами, половыми и соматическими клетками. В перспективе биотехнология рассматривается как основа ускоренного воспроизводства высокопродуктивных животных и целых популяций.

   В последнее время приобрела  практическое значение трансплантация  эмбрионов, которая рассматривается  как эффективный метод   биотехнологии ускоренного размножения высокоценных племенных животных.(2)

Принципиальная биологическая  возможность искусственного осеменения заключена в огромном «перепроизводстве» спермиев в организме самцов. Для  оплодотворения яйцеклетки требуется  всего один спермий, а в дозе, вводимой при искусственном осеменении, их должно быть миллионы, а организм самца производит их миллиарды. Большие биологические потенции к воспроизводству имеются и у самок млекопитающих, в яичниках которых содержатся десятки и даже сотни тысяч ооцитов. Естественным путем лишь единицы из них реализуются в потомстве. В отличие от самцов препятст­вием на пути более рационального использования воспроизводительного потенциала самок млекопитающих является необходимость вынашивания ими потомства в период эмбрионального развития. Это препятствие может быть устранено, если самку использовать в роли донора, только не гамет, как самца, а эмбрионов. Для вынашивания же потомства необходим «инкубатор».

В настоящее время для этого  может быть использована единственная возможность - организм приемных матерей (реципиентов) того же вида. Поэтому, если одних коров использовать только в качестве доноров ранних эмбрионов, то других можно было бы использовать только в качестве реципиентов - естественного инкубатора для доращивания эмбрионов. Это позволило бы интенсифицировать воспроизводство отдельных самок за счет реализации потенциальных запасов яйцеклеток в их яичниках. Таким образом, за один год от ценных племенных коров можно было бы получить не одного, а значительно большее число потомков. При этом в качестве приемных матерей подойдут менее продуктивные, чем доноры, коровы или просто телки, собственная продуктивность которых еще неизвестна.(3)

Отбор коров-доноров и  реципиентов для трансплантации

Эффективность применения метода трансплантации эмбрионов во многом зависит от клинического и физиологического состояния коров, их способности реагировать на экзогенные гонадотропины и выделять достаточное число качественных зародышей. Следовательно, одним из наиболее существенных моментов в технологии трансплантации эмбрионов, способных повысить эффективность метода является отбор доноров и реципиентов.

Исходя из того, что донор - животное высокой племенной ценности, то первое, на что обращают внимание при их отборе - это молочная продуктивность, которая за ряд лактаций должна быть на 50-60% выше стандарта данной породы, а содержание жира в молоке - на20% и более. Число учитываемых признаков может быть расширено в зависимости от поставленных селекционных целей. Например, содержание белка в молоке, пригодность к машинному доению (форма вымени, скорость молокоотдачи), крепость конституции, экстерьер и т.д. Племенная ценность донора, наряду с оценкой собственного генотипа, должна подтверждаться продуктивностью родителей. Коровы-доноры должны иметь известное происхождение, подтвержденное документально по системам групп крови. В большинстве случаев в качестве доноров используют лактирующих или выбракованных коров (не связанных с гинекологической патологией), в возрасте от 4 до 8 лет, живой массой 500-650 кг, с удоем по наивысшей лактации не ниже 7 тыс. кг молока, жирностью 3,7% и более.

Не менее важным, а может и  определяющим фактором при отборе доноров  является состояние репродуктивных органов. Поэтому для гормональной обработки следует отбирать животных не ранее, чем через 2,5-3 месяца после отела. При этом уменьшение размеров матки до физиологически необходимых размеров не может служить гарантией готовности давать эмбрионы высокого качества. Такой гарантией может быть только проведение клинического обследования предполагаемого донора, которое при необходимости дает возможность определить направление восстановления функций размножения на основе экзогенной гормонотерапии.

Целесообразно проводить разовую  индукцию полиовуляции потенциальных доноров с целью выяснения ответной реакции яичников на введение гонадотропина, после чего делается окончательное заключение о пригодности животного к использованию в технологии трансплантации. Коровы и телки с положительной ответной суперовулирующей реакцией (10 и более овуляций) и давшие не менее 4-х жизнеспособных эмбриона за первую обработку переводятся в группу постоянных доноров.

Оптимальный интервал между повторными обработками животных - 60-70 дней, в  этом случае от донора можно извлекать эмбрионы до 5 раз в год. В технологии трансплантации эмбрионов коров-доноров с уровнем реакции полиовуляции до 6 желтых тел можно использовать повторно через 35-45 дней.

Дополнительными критериями отбора животных для трансплантации эмбрионов являются гормональный статус и метаболическая активность потенциальных доноров. Для получения от донора не менее 10 овуляций и 6 жизнеспособных эмбрионов необходимо, чтобы в крови коров содержание эстрадиола было на уровне 15,4 пг/мл, тестостерона - 0,18 нг/мл, ЛГ - 1,46 МЕ/л на 0-й день полового цикла, а также прогестерона - от 2,0 до 5,0 нг/мл (в среднем 3,55) и ЛГ - 1,54 МЕ/л на 10-й день полового цикла. Вызывание суперовуляции может быть эффективным при содержании в крови холестерина не менее 3,55 ммоль/л, β-каротина - 8,88 мкмоль/л, витамина А - 4,36 мкмоль/л, активность аланинаминотрансферазы не ниже 0,24 мкмоль/л.(4)

Сервис-период более точно и  намного раньше, чем интервал  между отелами, выявляет потенциальные  возможности воспроизводительной  функции у коров. Он тесно связан с межотельным периодом (коэффициент корреляции составляет 0.9). Оптимальный сервис-период не должен превышать 80 дней. Однако анализ сервис-периода, проведенный в ведущих племенных стадах черно-пестрой породы, показал, что данный показатель воспроизводительной функции коров имеет высокий коэффициент изменчивости, который составил 61%.

Сервис-период в основном зависит  от интервала между отелом и первым осеменением, и интервала между  первым и последним, т.е. эффективным  осеменением. Высокопродуктивных коров следует осеменять на втором месяце после нормального отела. Это обусловлено тем, что первый половой цикл проявляется слабо, половая охота клинически плохо определяется или вовсе не обнаруживается.

Первое осеменение коров на втором месяце после отела не удлиняет сервис- и межотельный период. При оптимальном сервис-периоде до 80 дней после первого и второго осеменений средняя оплодотворяемость коров составляет 95-98%, а продолжительность межотельного периода не превышает одного года.

Для оценки воспроизводительных способностей коров, отобранных в качестве потенциальных доноров, необходимо анализировать такие параметры как оплодотворяемость от первого осеменения и индекс осеменения. При правильной технике осеменения и своевременном определении половой охоты оплодотворяемость коров от первого осеменения должна составлять в среднем 60%.

Важным показателем воспроизводительной  способности коров является индекс осеменения, т.е. количество осеменений на одно оплодотворение. Индекс осеменения характеризуется высокой степенью изменчивости - коэффициент вариабельности может достигать 70%.

Существенное влияние на изменчивость индекса осеменения оказывают такие  факторы, как продолжительность  периода от отела до первого осеменения, своевременное выявление коров в половой охоте, оплодотворяющая способность спермы быка и др. Индекс осеменения коров, выделенных в группу потенциальных доноров, не должен превышать 1.5. В идеальном случае потенциальная корова-донор должна иметь индекс осеменения равный 1. У коров-доноров при всех отелах должны отсутствовать осложнения (мертворождаемость, задержание последа, послеродовые заболевания половых органов).(1)

В качестве реципиентов используются телки случного возраста (16-18 месяцев) не представляющие племенной ценности, живой массой 380-400 кг. Не рекомендуется использовать телок с низкой живой массой.

Реципиенты должны быть клинически здоровы, внутренние и наружные половые  органы хорошо развиты, половой цикл должен соответствовать физиологическим  параметрам. При ректальном исследовании матка и яичники реципиента должны находиться в тазовой полости. Шейка матки должна быть четко выражена, длиной 7-12 см, диаметром 2,5-3,0 см. Длина рогов матки от 20 до 35 см. Яичники должны иметь округлую или овальную форму, плотную консистенцию, размер 3х2 см у коров и 2,0х1,5 см у телок.

Исследованиями выявлена зависимость  приживляемости зародышей от морфофункционального состояния органов воспроизведения  реципиентов. У телок-реципиентов  с нормально развитой половой  системой уровень стельности в среднем составляет 57%, в то время как при отклонениях в развитии половой системы - 20%.

При отборе потенциальных реципиентов  следует также учитывать параметры  половой цикличности. В качестве реципиентов следует использовать телок с продолжительностью полового цикла 19-22 дня, поскольку у животных с менее (16-18) или более (23-26дней) продолжительным циклом отмечено достоверное снижение приживляемости зародышей на 15-20%.

При отборе потенциальных реципиентов  для трансплантации существенное значение имеет определение качества желтого тела животного. Если на яичнике реципиента пальпируется желтое тело отличного качества (размер 1,0-1,5 см, выступает над поверхностью яичника, имеет грибовидную форму) или хорошего качества (размер 0,7-1,0 см, округлая или грибовидная форма), то уровень приживляемости зародышей составляет 53-57%. При удовлетворительном желтом теле (размер 0,5 см, округлая форма) уровень стельности находится в пределах 28-30%. Не рекомендуется использовать для пересадки эмбриона реципиента, на яичниках которого имеется одновременно желтое тело и фолликул до 1,0 см.

Для более объективной оценки функциональной активности яичников и снижения эмбриональной  смертности при трансплантации, наряду с диагностированием качества желтых тел, следует проводить определение концентрации стероидных гормонов и биохимических показателей крови реципиентов на 6-7 день естественного или индуцированного полового цикла.

Пересадку эмбрионов следует проводить  реципиентам, независимо от качества желтого  тела, с уровнем прогестерона в крови от 2,0 до 4,9 нг/мл. Соотношение прогестерона к эстрадиолу должно быть 1:10. В случае использования телок в качестве реципиентов с уровнем прогестерона свыше 5 нг/мл приживляемость снижается на 10-17%, а с уровнем ниже 2,0 нг/мл - на 25-30%. Содержание холестерина должно быть в пределах от 2,60-3,90 мкмоль/л, β-каротина - 12,2-17,3 мкмоль/л.

После ветеринарных обработок коров  и телок для трансплантации эмбрионов  их можно использовать только через 3 недели. На каждого донора следует готовить 5-6 реципиентов.

Диагностика стельности реципиентов  проводится ректальным методом спустя 2-3 месяца после эмбриопересадок.

Кормление доноров и реципиентов  должно быть биологически полноценным. Недостаточный уровень кормления, несбалансированность рациона по общей питательности и другим жизненно важным элементам, использование кормов низкого качества ведут к нарушению обмена веществ, что оказывает отрицательное влияние на эффективность гормонального вызывания суперовуляции, качество полученных эмбрионов и их приживляемость.

Вызывание суперовуляции  у коров-доноров 

Для вызывания суперовуляции у  крупного рогатого скота используются гонадотропные препараты (гонадотропин сыворотки жеребых кобыл - ГСЖК и  фолликулостимулирующий гормон - ФСГ - гипофиза животных), для синхронизации половых циклов - аналоги простагландина Ф2-альфа (эстрофан, магэстрофан, клопростенол, суперфан, ремофан, клатрапростин, эстуфалан и др.). Препараты ГСЖК обладают комплексной фолликулостимулирующей и лютеинизирующей активностью. Период полураспада экзогенного ГСЖК у коров составляет около 6 дней. Соотношение ФСГ и ЛГ в различных партиях неодинаковое, что сказывается на результативности суперовуляции. Стимуляция роста фолликулов препаратами ГСЖК сопровождается, как правило, увеличением массы яичников, образованием после овуляции разного числа и величины желтых тел. Из-за длительного распада ГСЖК в крови животных накапливаются повышенные концентрации гормонов. Изменение эндокринного статуса при индукции суперовуляции может оказывать неблагоприятное действие на оплодотворяемость яйцеклеток, развитие зародышей, а также на физиологическое состояние половых органов (в частности, наблюдается кистозное перерождение яичников). Для исключения длительной стимуляции роста фолликулов применяется анти-СЖК. Обработка антисывороткой в день проявления охоты нейтрализует циркулирующую в крови животных ГСЖК и тем самым прекращает дальнейшую стимуляцию роста фолликулов в яичниках. Это создает более благоприятный фон для овуляции, оплодотворяемости яйцеклеток и последующего развития зародышей. В практике используются стандартные гонадотропные препараты высокой степени очистки: сергон (Чехия), фоллигон (Голландия), прегмагон (Германия). Эти препараты инъецируют донорам на 11-12-ый день полового цикла, однократно, в дозе 50 И.Е. на 100 кг живой массы животного. Применение этих гонадотропинов обеспечивает вызывание множественной овуляции у 75-78% животных и получение в среднем 3,5-4,0 жизнеспособных эмбриона на донора.