Принципы оценки иммунного статуса
Иммунный
статус определяется количеством и активностью
лимфоидных и фагоцитарных клеток, находящихся
в циркуляции, состоянием системы комплемента,
факторов неспецифической резистентности,
киллерными клетками, иммуноглобулинами,
специфическими AT, ИЛ и другими показателями.
Все параметры иммунного статуса можно
разделить на: 1) неспецифические, отражающие
общие изменения иммунной системы; 2) связанные
с данной патологией опосредованно, и
3) специфические, устанавливающие конкретные
иммунные механизмы заболеваний. Неспецифические
показатели. Наиболее широко распространённые
методы оценки иммунного статуса связаны
с лимфоцитами. Для их выделения разработаны
различные методические приёмы.
Создаются градиенты
плотности сред, задерживающие именно
эти клетки за счет их плотности: фиколл-верографин,
фиколл-гипак, плазма-перколл и др. В ряде
случаев от эритроцитов освобождаются
с помощью различных лизирующих растворов
и т.д. Оценка состояния трёх основных
звеньев иммунитета — Т-, В- и фагоцитарного,
разделяется на количественную и функциональную.
Количественное тестирование популяций
и субпопуляций лимфоцитов основано на
характеристике специфических для каждого
вида клеток рецепторов, по их способности
связываться с Аг либо с клетками. Так,
Т-лимфоциты, например, несут рецепторы
к эритроцитам барана и образуют с ними
так называемые Е-РОК. Подсчитав процент
таких клеток и переведя его в абсолютные
значения, можно определить содержание
Т-лимфоцитов. В-клетки образуют розетки
либо с эритроцитами мышей, либо с эритроцитами
быка, нагруженными AT против них и комплементом
— ЕАС-РОК.
Более чувствительной
является идентификация клеток с помощью
моноклональных AT против маркерных Аг
популяций и субпопуляций лимфоцитов.
Исследуемые лимфоциты обрабатывают монокло-нальными
AT (анти-CD), далее либо диагностикумами,
нагруженными AT против «первых» AT, либо
AT и их Fab-фрагментами (против «первых»
AT), мечеными флуорохромами, дающими специфическое
свечение в люминесцентном микроскопе.
Созданы лазерные сортеры (проточные цитофлуориметры)
для выявления субпопуляций лимфоцитов,
меченых таким образом моноклональными
AT.
Для оценки функциональной
активности клеточного звена иммунитета
используют 4 группы методов.
1. Постановка кожных
проб ГЗТ.
2. Стимуляция лимфоцитов
in vitro в РБТЛ
3. Функциональная оценка
Т-хелперов.
4. Функциональная оценка
Т-супрессоров (киллерных клеток и т. д.).Для
постановки кожных проб используется:
очищенный туберкулин (реакция Пирке),
паротитный, стрептококковый, столбнячный,
дифтерийный Аг, трихофитии, кандидин,
стрептокиназа, динитрох-лорбензол и др.
Стимуляция лимфоцитов
в РБТЛ основана на способности лимфоцитов
при определённых условиях превращаться
в увеличенные бластоподобные клетки,
активно синтезирующие ДНК. Для характеристики
функции Т-хелперов мононуклеарные клетки
крови инкубируются с поликлональным
активатором лимфоцитов митогеном лаконоса
и количественно измеряют индуцированную
им продукцию иммуноглобулинов. Далее
в систему добавляют клетки с предполагаемой
хелперной способностью и определяют
прирост образования иммуноглобулинов.
Для оценки функции Т-супрессоров воспроизводится
описанная выше методика, но в культуру
добавляют клетки с супрессорной активностью,
регистрируя снижение суммарных иммуноглобулинов.
Одним из методов оценки
функциональной активности В-лимфо-цитов
является оценка синтеза иммуноглобулинов
в культуре этих клеток, а также определение
в сыворотке крови, слюне, кишечном содержимом
количества иммунных глобулинов основных
классов. Для этого используется метод
двумерной диффузии в агаровом геле, разработанный
Манчини (в лунки агарового геля, содержащего
AT к различным классам иммуноглобулинов,
добавляют искомые сыворотки, содержащие
Ig, образуются кольца преципитации, размер
которых по номограммам позволяет определить
концентрацию Ig разных классов). Дополнительным
показателем в оценке гуморального иммунитета
является определение концентрации естественных
AT, например, изогемагглютининов (титр
в норме 1:16—1:64), уровень AT к кишечной палочке,
Аг коклюшного возбудителя, дифтерии,
столбняка, поскольку подавляющее большинство
людей иммунизировано данными Аг в плановом
порядке, т.е. AT против указанных Аг должны
быть у всех.
Для измерения функции
системы фагоцитоза изучается микробоцидная
способность, фагоцитарная активность,
подвижность моноцитов и гранулярных
лейкоцитов (гранулоцитов). Метаболическая
способность определяется косвенным путем
в тесте восстановления нитросинего тетразолия,
используя спонтанную и индуцированную
реакции. Кислородный метаболизм фагоцитов
также изучают методом хе-милюминесценции,
который обусловлен генерацией Н202 и супероксидного
радикала и прямо коррелирует с киллерной
способностью клетки. Применяющиеся методы
позволяют определить непосредственно
кислородный метаболизм, образование
различных активных кислородных радикалов
индивидуальными клетками. Последний
анализ может выполняться на проточном
цитофлуориметре.
Поглотительные возможности
определяют в реакции фагоцитоза указанных
клеток каких-либо объектов: бактерий,
дрожжевых клеток, частиц латекса, зимозана
и т.д. Подсчитывается процент фагоцитирующих
лейкоцитов и фагоцитарный индекс, отражающий
среднее число поглощённых одним фагоцитом
частиц при подсчете 100 клеток. Для оценки
функциональных резервов фагоцитирующих
клеток использовали фагоцитарную реакцию
с определением фагоцитарного показателя
и фагоцитарного числа. Для определения
переваривающей способности клеток реакцию
учитывали через 30 мин и через 2 ч. В качестве
стимулятора in vitro использовали продигиозан.
Киллерная способность фагоцитов может
быть определена непосредственно по киллингу
живых дрожжей, который оценивается с
помощью красителя акридинового оранжевого,
применяются и специальные красители,
позволяющие определить киллинг бактерий
отдельными фагоцитами на проточном цитофлуориметре.
Подвижность фагоцитов,
в частности нейтрофильных гранулоцитов
или моноцитов периферической крови, измеряется
либо по величине спонтанной миграции
из капилляров за определённый промежуток
времени, либо по измерению этой реакции
в присутствии веществ, обладающих хемотаксическим
действием. Анализируется также адгезия
на поверхность или их агрегация, четко
отражающие функциональную активность
клеток, в том числе обусловливаемую молекулами
адгезии. Определение рецепторов на нейтрофилах
или моноцитах также проводится для оценки
функциональной активности фагоцитарной
системы. Оценка системы комплемента производится
в гемолитической системе, состоящей из
эритроцитов барана со специфической
антисывороткой к ним. Сыворотку предварительно
прогревают при 56° С в течение 30 мин для
разрушения собственного комплемента,
а затем добавляют её в исследуемую сыворотку
как источник AT. Рассчитывается 50% гемолиз,
содержание комплемента выражают в единицах
С'Н50 (единица активности комплемента,
за которую принимают количество комплемента,
вызывающее 50% лизис определённого количества
сенсибилизированных специфическими
AT эритроцитов).
Количественное определение
компонентов комплемента и ингибиторов
проводится иммунохимическим методом
с использованием моноспецифических анти-сывороток
по методу Манчини или в системе, где отсутствует
какой-либо определённый компонент системы
комплемента, а остальные ее компоненты
присутствуют в избытке. Активность киллерных
клеток измеряется в пробах с мишенями,
мечеными радиоактивными изотопами, которые
выделяются в культурную среду после разрушения
клеток киллером.
К специфическим методам
оценки иммунного статуса относят иммунофлуоресценцию
— использование AT, меченых иммунофлуоресцирующим
красителем, например флуоресцеи-ном изотиоцианатом,
родамином и др. С их помощью обнаруживают
места локализации Аг. В ультрафиолетовом
свете они хорошо видны. При радиоиммунном
методе используют меченые радионуклидами
I131 или I125 (радиоизотопы йода) AT или Аг.
Применяют стандартное количество антисыворотки,
связывающей 70—80% меченого Аг. Затем в
реагирующую систему вносят искомый немеченый
Аг. Он конкурирует с меченым за AT. Суммарная
радиоактивность реагирующей системы
падает. Чем больше немеченого Аг в системе,
тем в большей степени снижается её радиоактивность,
которую можно измерить, и по полученным
данным определить содержание искомого
(немеченого) Аг в исследуемой смеси.Метод
иммуноферментного анализа (ИФА) чувствителен
и достаточно прост. Реакцию обычно ставят
в пластиковых планшетах, к полистиролу
лунок фиксируют AT к Аг, который следует
обнаружить в материале; в другой модификации
можно использовать маркерный Аг. Далее
вносится исследуемый субстрат, содержащий
искомый Аг. Он соединяется с AT, образуя
комплекс Аг-АТ. Не прореагировавший исследуемый
субстрат удаляют и вместо него вносят
AT, меченые каким-либо ферментом, например,
пероксидазой хрена. Они присоединяются
к комплексу Аг-АТ, адсорбированному на
полистироле лунки. Далее в систему вносят
вещество, дающее цветную реакцию в присутствии
пероксидазы хрена. По интенсивности окрашивания
количественно оценивается реакция.