Рекомбинация у бактерий

Рекомбинация у бактерий

 

Генетическая рекомбинация - это взаимодействие между двумя ДНК, обладающими различными генотипами, которое приводит к образованию рекомбинантной ДНК, сочетающей гены обоих родителей.

Особенности рекомбинации у бактерий определяет отсутствие полового размножения и мейоза, в процессе которых у высших организмов происходят рекомбинация, гаплоидный набор генов. В процессе рекомбинации бактерии условно делятся на клеткидоноры, которые передают генетический материал, и клеткиреципиенты, которые воспринимают его. В клетку-реципиент проникает не вся, а только часть хромосомы клетки-донора, что приводит к формированию неполной зиготы - мерозиготы. В результате рекомбинации в мерозиготе образуется только один рекомбинант, генотип которого представлен в основном генотипом реципиента, с включенным в него фрагментом хромосомы донора. Реципрокные рекомбинанты не образуются.

По молекулярному механизму генетическая рекомбинация у бактерий делится на гомологичную, сайтспецифическую и незаконную.

 

Гомологичная рекомбинация

При гомологичной рекомбинации в процессе разрыва и воссоединения ДНК происходит обмен между участками ДНК, обладающими высокой степенью гомологии. Процесс гомологичной рекомбинации находится под контролем генов, объединенных в REC-систему, состоящую из генов recA, B, C, D. Продукты этих генов производят расплетание нитей ДНК и их переориентацию с образованием полухиазмы, структуры Холидея, а также разрезают структуру Холидея для завершения процесса рекомбинации.

 

Сайтспецифическая рекомбинация

Этот тип рекомбинации не зависит от функционирования генов recA, B, C, D, не требует протяжных участков гомологии ДНК, но для протекания которой необходимы строго определенные последовательности ДНК и специальный ферментативный аппарат, которые специфичны для каждого конкретного случая. Примером этого типа рекомбинации является встраивание плазмиды в хромосому бактерий, которое происходит между идентичными IS- элементами хромосомы и плазмиды, интеграция ДНК фага лямбда в хромосому Е. coli. Сайтспецифическая рекомбинация, происходящая в пределах одного репликона, участвует также в переключении активности генов. Например, у сальмонелл следствием этого процесса являются фазовые вариации жгутикового Н-антигена.

 

Незаконная или репликативная рекомбинация

Незаконная или репликативная рекомбинация не зависит от функционирования генов recA, B, C, D. Примером ее является транспозиция подвижных генетических элементов по репликону или между репликонами, при этом, как уже было отмечено в разделе 5.1.3, транспозиция подвижного генетического элемента сопровождается репликацией ДНК.

Рекомбинация у бактерий является конечным этапом передачи генетического материала между бактериями, которая осуществляется тремя механизмами: конъюгацией (при контакте бактерий,

одна из которых несет конъюгативную плазмиду), трансдукцией (при помощи бактериофага), трансформацией (при помощи высокополимеризованной ДНК).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Трансформация

 

Феномен трансформации впервые был описан в 1928 г. Ф. Гриффитсом, обнаружившим превращение бескапсульного R-штамма пневмококков (Streptococcus pneumoniae) в штамм, образующий капсулу S-формы. Гриффитс ввел мышам одновременно небольшое количество авирулентных R-клеток и убитых нагреванием S-клеток. R-клетки были получены от штамма, капсульное вещество которого принадлежало к типу S II, а убитые нагреванием S-штаммы - к типу S III. Из крови погибших мышей были выделены вирулентные пневмококки с капсулой S III.

 

В 1944 г. О. Эвери, К. Мак-Леод, М. Мак-Карти установили природу трансформирующего фактора, показав, что ДНК, экстрагированная из инкапсулированных пневмококков, может трансформировать некапсулированные пневмококки в инкапсулированную форму. Таким образом, было доказано, что именно ДНК является носителем генетической информации.

 

Процесс трансформации может самопроизвольно происходить в природе у некоторых видов бактерий, B. subtilis, H. influenzae, S. pneumoniae, когда ДНК, выделенная из погибших клеток, захватывается реципиентными клетками. Процесс трансформации зависит от компетентности клетки-реципиента и состояния донорской трансформирующей ДНК. Компетентность - это способность бактериальной клетки поглощать ДНК. Она зависит от присутствия особых белков в клеточной мембране, обладающих специфическим аффинитетом к ДНК. Состояние компетентности у грамположительных бактерий связано с определенными фазами кривой роста. Состояние компетенции у грамотрицательных бактерий приходится создавать искусственным путем, подвергая бактерии температурному или электрошоку.

 

Трансформирующей активностью обладает только двунитевая высокоспирализованная молекула ДНК. Это связано с тем, что в клетку-реципиент проникает только одна нить ДНК, тогда как другая - на клеточной мембране - подвергается деградации с высвобождением энергии, которая необходима для проникновения в клетку сохранившейся нити. Высокая молекулярная масса трансформирующей ДНК увеличивает шанс рекомбинации, так как внутри клетки трансформирующая нить ДНК подвергается воздействию эндонуклеаз. Интеграция с хромосомой требует наличия гомологичных с ней участков у трансформирующей ДНК. Рекомбинация происходит на одной нити, в результате чего образуется гетеродуплексная молекула, одна нить которой имеет генотип реципиента, а другая - рекомбинантный генотип. Рекомбинантные трансформанты формируются только после цикла репликации (рис. 5.5).

 

В настоящее время этот метод является основным методом генной инженерии, используемым при конструировании рекомбинантных штаммов с заданным геномом.

 

 

 

Конъюгация

Передача генетического материала от клетки-донора в клеткурепипиент путем непосредственного контакта клеток называется конъюгацией, которая впервые была обнаружена Дж. Ледербергом и Э. Тейтумом в 1946 г.

Необходимым условием для конъюгации является наличие в клетке-доноре трансмиссивной плазмиды. Трансмиссивные плазмиды кодируют половые пили, образующие конъюгационную трубочку между клеткой-донором и клеткой-реципиентом, по которой плазмидная ДНК передается в новую клетку. Механизм передачи плазмидной ДНК из клетки в клетку заключается в том, что специальный белок, кодируемый tra-опероном, узнает определенную последовательность в ДНК плазмиды (называемую от англ. origin - начало), вносит в эту последовательность одноцепочечный разрыв и ковалентно связывается с 5'-концом. Затем цепь ДНК, с которой связан белок, переносится в клетку-реципиент, а неразорванная комплементарная цепь остается в клетке-доноре. Клеточный аппарат синтеза ДНК достраивает одиночные цепи и в доноре, и в реципиенте до двухцепочечной структуры. Белок, связанный с 5'-концом перенесенной цепи, способствует замыканию плазмиды в реципиентной клетке в кольцо. Этот процесс представлен на рис. 5.3, а на примере переноса в реципиентную клетку плазмиды F (от англ. fertility - плодовитость), которая является как трансмиссивной, так и интегративной плазмидой. Клеткидоноры, обладающие F-фактором, обозначаются как F+-клетки, а клетки-реципиенты, не имеющие F-фактора, обозначаются как F-- клетки. Если F-фактор находится в клетке-доноре в автономном состоянии, то в результате скрещивания F+ * F- клетка-реципиент приобретает донорские свойства.

Если F-фактор или другая трансмиссивная плазмида встраиваются в хромосому клетки-донора, то плазмида и хромосома начинают функционировать в виде единого трансмиссивного репликона, что делает возможным перенос бактериальных генов в бесплазмидную клетку-реципиент, т.е. процесс конъюгации. Штаммы, в которых плазмида находится в интегрированном состоянии, переносят свои хромосомные гены бесплазмидным клеткам с высокой частотой и поэтому называются Hfr (от англ. high frequency of recombination - высокая частота рекомбинации) (рис. 5.3, б).

 

Процесс переноса хромосомных генов в случае скрещивания Hfr χ F- всегда начинается с расщепления ДНК в одной и той же точке - в месте интеграции F-фактора или другой трансмиссивной плазмиды. Одна нить донорской ДНК передается через конъюгационный мостик в реципиентную клетку. Процесс сопровождается достраиванием комплементарной нити до образования двунитевой структуры. Перенос хромосомных генов при конъюгации всегда имеет одинаковую направленность, противоположную встроенной плазмиде. Сама трансмиссивная плазмида передается последней. Переданная в реципиентную клетку и достроенная до двунитевой структуры нить ДНК донора рекомбинирует с гомологичным участком реципиентной ДНК с образованием стабильной генетической структуры. Из-за хрупкости конъюгационного мостика половой фактор редко передается в клетку-реципиент, поэтому образовавшийся рекомбинант донорскими функциями, как правило, не обладает.

Вследствие направленности передачи генов конъюгация используется для картирования генома бактерий и построения генетической карты.

 

Схема конъюгации у бактерий: а - передача F плазмиды из F+- в F--клетку; б - передача бактериальной хромосомы Hfr * F-

Трансдукция

Трансдукцией называют передачу бактериальной ДНК посредством бактериофага. Этот процесс был открыт в 1951 г. Н. Циндером и Дж. Ледербергом. В процессе репликации фага внутри бактерий (см. раздел 3.3) фрагмент бактериальной ДНК проникает в фаговую частицу и переносится в реципиентную бактерию во время фаговой инфекции. Существует два типа трансдукции: общая трансдукция - перенос бактериофагом сегмента любой части бактериальной хромосомы - происходит вследствие того, что в процессе фаговой инфекции бактериальная ДНК фрагментируется, и фрагмент бактериальной ДНК того же размера, что и фаговая ДНК, проникает в фаговую головку, формируя дефектную фаговую частицу. Этот процесс происходит с частотой приблизительно 1 на 1000 фаговых частиц (рис. 5.4, а). При инфицировании клетки-реципиента дефектной фаговой частицей ДНК клеткидонора «впрыскивается» в нее и рекомбинирует гомологичной рекомбинацией с гомологичным участком хромосомы-реципиента с образованием стабильного рекомбинанта. Этим типом трансдукции обладают Р-фаги. Специфическая трансдукция наблюдается в том случае, когда фаговая ДНК интегрирует в бактериальную хромосому с образованием профага. В процессе исключения ДНКфага из бактериальной хромосомы в результате случайного процесса захватывается прилегающий к месту включения фаговой ДНК фрагмент бактериальной хромосомы, становясь дефектным фагом (рис. 5.4, б). Так как большинство умеренных бактериофагов интегрирует в бактериальную хромосому в специфических участках, для таких бактериофагов характерен перенос в клетку-реципиент определенного участка бактериальной ДНК клетки-донора. ДНК дефектного фага рекомбинирует с ДНК клетки-реципиента сайтспецифической рекомбинацией. Рекомбинант становится меродиплоидом по привнесенному гену. В частности, бактериофаг передает специфической трансдукцией gal-ген у Е. coli.

Схема трансдукции: а - неспецифическая (общая); б – специфическая

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Плазмиды бактерий

Плазмиды представляют собой двухцепочечные молекулы ДНК размером от 103 до 106 н.п. Они могут быть кольцевой формой и линейными. Плазмиды кодируют не основные для жизнедеятельности бактериальной клетки функции, но придающие бактерии преимущества при попадании в неблагоприятные условия существования.

Среди фенотипических признаков, сообщаемых бактериальной клетке плазмидами, можно выделить следующие:

•  устойчивость к антибиотикам;

•  продукцию факторов патогенности;

•  способность к синтезу антибиотических веществ;

•  образование колицинов;

•  расщепление сложных органических веществ;

•  образование ферментов рестрикции и модификации. Репликация плазмид происходит независимо от хромосомы с участием того же набора ферментов, который осуществляет репликацию бактериальной хромосомы .

Некоторые плазмиды находятся под строгим контролем. Это означает, что их репликация сопряжена с репликацией хромосомы так, что в каждой бактериальной клетке присутствует одна или, по крайней мере, несколько копий плазмид.

Число копий плазмид, находящихся под слабым контролем, может достигать от 10 до 200 на бактериальную клетку.

Для характеристики плазмидных репликонов их принято разбивать на группы совместимости. Несовместимость плазмид связана с неспособностью двух плазмид стабильно сохраняться в одной и той же бактериальной клетке. Несовместимость свойственна тем плазмидам, которые обладают высоким сходством репликонов, поддержание которых в клетке регулируется одним и тем же механизмом.

Плазмиды, которые могут обратимо встраиваться в бактериальную хромосому и функционировать в виде единого репликона, называются интегративными или эписомами.

Плазмиды, способные передаваться из одной клетки в другую, иногда даже принадлежащую иной таксономической единице, называются трансмиссивными (конъюгативными) Трансмиссивность присуща лишь крупным плазмидам, имеющим tra-оперон, в который объединены гены, ответственные за перенос плазмиды. Эти гены кодируют половые пили, которые образуют мостик с клеткой, не содержащей трансмиссивную плазмиду, по которой плазмидная ДНК передается в новую клетку. Этот процесс называется конъюгацией (подробно он будет рассмотрен в разделе 5.4.1). Бактерии, несущие трансмиссивные плазмиды, чувствительны к «мужским» нитевидным бактериофагам.

Мелкие плазмиды, не несущие tra-гены, не могут передаваться сами по себе, но способны к передаче в присутствии трансмиссивных плазмид, используя их аппарат конъюгации. Такие плазмиды называются мобилизуемыми, а сам процесс - мобилизацией нетрансмиссивной плазмиды.

Особое значение в медицинской микробиологии имеют плазмиды, обеспечивающие устойчивость бактерий к антибиотикам, которые получили название R-плазмид (от англ. resistance - противодействие), и плазмиды, обеспечивающие продукцию факторов патогенности, способствующих развитию инфекционного процесса в макроорганизме. R-плазмиды содержат гены, детерминирующие синтез ферментов, разрушающих антибактериальные препараты (например, антибиотики). В результате наличия такой плазмиды бактериальная клетка становится устойчивой (резистентной) к действию целой группы лекарственных веществ, а иногда и к нескольким препаратам. Многие R-плазмиды являются трансмиссивными, распространяясь в популяции бактерий, делая ее недоступной к воздействию антибактериальных препаратов. Бактериальные штаммы, несущие R-плазмиды, очень часто являются этиологическими агентами внутрибольничных инфекций.