Современные методы микроскопических исследований

Реферат на тему:

Современные методы микроскопических исследований

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Содержание

1. Введение ………………………………………………………………….3
2. Виды микроскопии:………………………………………………………4

• Световая микроскопия…………………………………………………...4

• Фазово-контрастная микроскопия………………………………………4
• Интерференционная микроскопия……………………………………....5
• Поляризационная микроскопия…………………………………………5
• Люминесцентная микроскопия………………………………………….6
• Ультрафиолетовая микроскопия………………………………………...7
• Инфракрасная микроскопия……………………………………………..7
• Стереоскопическая микроскопия………………………………………..7
• Электронная микроскопия……………………………………………….7

3. Некоторые виды современных микроскопов…………………………...8

4. Заключение………………………………………………………………10
5. Список использованной литературы…………………………………...11

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

Микроскопические методы исследования - способы изучения различных  объектов с помощью микроскопа. В  биологии и медицине эти методы позволяют  изучать строение микроскопических объектов, размеры которых лежат  за пределами разрешающей способности  глаза человека. Основу микроскопических методов исследования (М.м.и.) составляет световая и электронная микроскопия. В практической и научной деятельности врачи различных специальностей - вирусологи, микробиологи, цитологи, морфологи, гематологи и др. помимо обычной световой микроскопии используют фазово-контрастную, интерференционную, люминесцентную, поляризационную, стереоскопическую, ультрафиолетовую, инфракрасную микроскопию. В основе этих методов лежат различные свойства света. При электронной микроскопии изображение объектов исследования возникает за счет направленного потока электронов.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Виды  микроскопии

 

Световая микроскопия

Для световой микроскопии и основанных на ней других М.м.и. определяющее значение помимо разрешающей способности  микроскопа имеет характер и направленность светового луча, а также особенности  изучаемого объекта, который может  быть прозрачным и непрозрачным. В  зависимости от свойств объекта  изменяются физические свойства света - его цвет и яркость, связанные  с длиной и амплитудой волны, фаза, плоскость и направление распространения  волны. На использовании этих свойств света и строятся различные М. м. и. Для световой микроскопии биологические объекты обычно окрашивают с целью выявления тех или иных их свойств (рис. 1). При этом ткани должны быть фиксированы, т. к. окраска выявляет определенные структуры только убитых клеток. В живой клетке краситель обособляется в цитоплазме в виде вакуоли и не прокрашивает ее структуры. Однако в световом микроскопе можно изучать и живые биологические объекты с помощью метода витальной микроскопии. В этом случае применяют темнопольный конденсор, который встраивают в микроскоп.

 

Рис. 1. Микропрепарат миокарда при внезапной смерти от острой коронарной недостаточности: окраска по Ли позволяет выявить контрактурные пересокращения миофибрилл (участки красного цвета); ×250.

Фазово-контрастная  микроскопия

Для исследования живых и  неокрашенных биологических объектов используют также фазово-контрастную  микроскопию. Она основана на дифракции  луча света в зависимости от особенностей объекта излучения. При этом изменяется длина и фаза световой волны. Объектив специального фазово-контрастного микроскопа содержит полупрозрачную фазовую пластинку. Живые микроскопические объекты  или фиксированные, но не окрашенные, микроорганизмы и клетки из-за их прозрачности практически не изменяют амплитуду  и цвет проходящего через них  светового луча, вызывая лишь сдвиг  фазы его волны. Однако, пройдя через  изучаемый объект, лучи света отклоняются  от полупрозрачной фазовой пластинки. В результате между лучами, прошедшими через объект, и лучами светового  фона возникает разность длины волны. Если эта разность составляет не менее 1/4 длины волны, то появляется зрительный эффект, при котором темный объект отчетливо виден на светлом фоне или наоборот в зависимости от особенностей фазовой пластинки.

Разновидностью фазово-контрастной  микроскопии является амплитудно-контрастная, или аноптральная, микроскопия, при которой применяют объектив со специальными пластинками, изменяющими только яркость и цвет фонового света. В результате расширяются возможности исследования живых неокрашенных объектов. Фазово-контрастная микроскопия находит применение в микробиологии и паразитологии при исследовании микроорганизмов, простейших, клеток растений и животных; в гематологии для подсчета и определения дифференцировки клеток костного мозга и крови; а также при изучении клеток культуры тканей и т. п.

Интерференционная микроскопия

Интерференционная микроскопия  решает те же задачи, что и фазово-контрастная. Но если последняя позволяет наблюдать лишь контуры объектов исследования, то с помощью интерференционной микроскопии можно изучать детали прозрачного объекта и проводить их количественный анализ. Это достигается благодаря раздвоению луча света в микроскопе: один из лучей проходит через частицу наблюдаемого объекта, а другой мимо нее. В окуляре микроскопа оба луча соединяются и интерферируют между собой. Возникающую разность фаз можно измерить, определив т. о. массу различных клеточных структур. Последовательное измерение разности фаз света с известными показателями преломления дает возможность определять толщину живых объектов и нефиксированных тканей, концентрацию в них воды и сухого вещества, содержание белков и т. д. На основании данных интерференционной микроскопии можно косвенно судить о проницаемости мембран, активности ферментов, клеточном метаболизме объектов исследования.

Поляризационная микроскопия

Поляризационная микроскопия позволяет  изучать объекты исследования в  свете, образованном двумя лучами, поляризованными  во взаимноперпендикулярных плоскостях, т. е. в поляризованном свете. Для этого используют пленчатые поляроиды или призмы Николя, которые помещают в микроскопе между источником света и препаратом. Поляризация меняется при прохождении (или отражении) лучей света через различные структурные компоненты клеток и тканей, свойства которых неоднородны. В так называемых изотропных структурах скорость распространения поляризованного света не зависит от плоскости поляризации, в анизотропных структурах скорость его распространения меняется в зависимости от направления света по продольной или

Рис. 2а). Микропрепарат миокарда в поляризо   поперечной оси объекта.

ванном  свете в норме. 

Если показатель преломления  света вдоль структуры больше, чем в поперечном направлении, возникает  положительное двойное лучепреломление, при обратных взаимоотношениях - отрицательное  двойное лучепреломление. Многие биологические  объекты имеют строгую молекулярную ориентацию, являются анизотропными  и обладают положительным двойным  преломлением света. Такими свойствами обладают миофибриллы, реснички мерцательного эпителия, нейрофибриллы, коллагеновые волокна и др. Сопоставление характера преломления лучей поляризованного света и величины анизотропии объекта позволяет судить о молекулярной организации его структуры (рис.2).Поляризационная микроскопия является одним из гистологических методов исследования, способом микробиологической диагностики, находит применение в цитологических исследованиях и др. При этом в поляризованном свете можно исследовать как окрашенные, так и неокрашенные и нефиксированные, так называемые нативные препараты срезов тканей.

Рис. 2б). Микропрепарат миокарда в поляризованном свете при внезапной смерти от острой коронарной недостаточности — выявляются участки, в которых отсутствует характерная поперечная исчерченность кардиомиоцитов; ×400.

Люминесцентная  микроскопия

Широкое распространение имеет люминесцентная микроскопия. Она основана на свойстве некоторых веществ давать свечение - люминесценцию в УФ-лучах или в сине-фиолетовой части спектра. Многие биологические вещества, такие как простые белки, коферменты, некоторые витамины и лекарственные средства, обладают собственной (первичной) люминесценцией. Другие вещества начинают светиться только при добавлении к ним специальных красителей -- флюорохромов (вторичная люминесценция). Флюорохромы могут распределяться в клетке диффузно либо избирательно окрашивают отдельные клеточные структуры или определенные химические соединения биологического объекта. На этом основано использование люминесцентной микроскопии при цитологических и гистохимических исследованиях. С помощью иммуно-флюоресценции в люминесцентном микроскопе выявляют вирусные антигены и их концентрацию в клетках, идентифицируют вирусы, определяют антигены и антитела, гормоны, различные продукты метаболизма и т. д. (рис. 3). В связи с этим люминесцентную микроскопию применяют в лабораторной диагностике таких инфекций, как герпес, эпидемический паротит, вирусный гепатит, грипп и др., используют в экспресс-

Рис. 3. Микропрепарат перитонеального макрофага

 в клеточной культуре, люминесцентная микроскопия.

диагностике респираторных  вирусных инфекций, исследуя отпечатки  со слизистой оболочки носа больных, и при дифференциальной диагностике  различных инфекций. В патоморфологии с помощью люминесцентной микроскопии распознают злокачественные опухоли в гистологических и цитологических препаратах, определяют участки ишемии мышцы сердца при ранних сроках инфаркта миокарда, выявляют амилоид в биоптатах тканей.

Ультрафиолетовая  микроскопия

Ультрафиолетовая микроскопия  основана на способности некоторых  веществ, входящих в состав живых  клеток, микроорганизмов или фиксированных, но не окрашенных, прозрачных в видимом  свете тканей, поглощать УФ-излучение с определенной длиной волн (400- 250 нм). Этим свойством обладают высокомолекулярные соединения, такие как нуклеиновые кислоты, белки, ароматические кислоты (тирозин, триптофан, метилаланин), пуриновые и пирамидиновые основания и др. С помощью ультрафиолетовой микроскопии уточняют локализацию и количество указанных веществ, а в случае исследования живых объектов - их изменения в процессе жизнедеятельности.

Инфракрасная  микроскопия

Инфракрасная микроскопия  позволяет исследовать непрозрачные для видимого света и УФ-излучения объекты путем поглощения их структурами света с длиной волны 750--1200 нм. Для инфракрасной микроскопии не требуется предварительной хим. обработки препаратов. Этот вид М. м. и. наиболее часто используют в зоологии, антропологии, других отраслях биологии. В медицине инфракрасную микроскопию применяют в основном в нейроморфологии и офтальмологии.

Стереоскопическая микроскопия

Для исследования объемных объектов используют стереоскопическую  микроскопию. Конструкция стереоскопических  микроскопов позволяет видеть объект исследования правым и левым глазом под разными углами. Исследуют  непрозрачные объекты при относительно небольшом увеличении (до 120 раз). Стереоскопическая  микроскопия находит применение в микрохирургии, в патоморфологии при специальном изучении биопсийного, операционного и секционного материала, в судебно-медицинских лабораторных исследованиях.

Электронная микроскопия

Для изучения на субклеточном и макромолекулярном уровнях  структуры клеток, тканей микроорганизмов  и вирусов используют электронную  микроскопию. Этот М. м. и. позволил перейти  на качественно новый уровень  изучения материи. Он нашел широкое  применение в морфологии, микробиологии, вирусологии, биохимии, онкологии, генетике, иммунологии. Резкое повышение разрешающей  способности электронного микроскопа обеспечивается потоком электронов, проходящих в вакууме через электромагнитные поля, создаваемые электромагнитными  линзами. Электроны могут проходить  через структуры исследуемого объекта (трансмиссионная электронная микроскопия) или отражаться от них (сканирующая  электронная микроскопия), отклоняясь под разными углами, в результате чего возникает изображение на люминесцентном экране микроскопа. При трансмиссионной (просвечивающей) электронной микроскопии получают плоскостное изображение структур (рис. 4), при сканирующей - объемное (рис. 5). Сочетание электронной микроскопии с другими методами, например, с радиоавтографией, гистохимическими, иммунологическими методами исследования, позволяет проводить электронно-радиоавтографические, электронно-гистохимические, электронно-иммунологические исследования.

Рис. 4. Электронограмма кардиомиоцита, полученная при трансмиссионной (просвечивающей) электронной микроскопии: отчетливо видны субклеточные структуры; ×22000.

Электронная микроскопия требует  специальной подготовки объектов исследования, в частности химической или физической фиксации тканей и микроорганизмов. Биопсийный материал и секционный материал после фиксации обезвоживают, заливают в эпоксидные смолы, режут стеклянными или алмазными ножами на специальных ультратомах, позволяющих получать ультратонкие срезы тканей толщиной 30--50 нм. Их контрастируют и затем изучают в электронном микроскопе. В сканирующем (растровом) электронном микроскопе изучают поверхность различных объектов, напыляя на них в вакуумной камере электронно-плотные вещества, и исследуют так наз. реплики, повторяющие контуры образца.