Спид

В то время как ген tat усиливает синтез всех вирусных белков без разбора, второй регуляторный ген, rev (от англ. regulator of virion-protein expression- регулятор экспрессии белков вириона) обладает избирательным действием, благодаря которому производятся либо регуляторные белки, либо компоненты вириона. Белок - продукт гена rev, как и в случае гена tat, кодируется разобщенными нуклеотидными последовательностями, которые соединяются в результате сплайсинга РНК. В регуляции этим белком участвуют еще две последовательности. Одна из них действует как репрессор: препятствует трансляции транскриптов, которые ее содержат. Другая последовательность взаимодействует с белком rev и снимает эффект первой последовательности.

Последовательность - репрессор, называемая CRS (от англ. cis-acting repression sequence), имеется в мРНК, по которым синтезируются белки, формирующие вирионы сердцевинные белки, ферменты репликации и белок оболочки; мРНК регуляторных белков - продуктов генов tat и самого rev - не содержат CRS. В отсутствие белка - продукта гена rev - последовательность CRS не дает накапливаться длинным мРНК, по которым синтезируются белки для вирионов. Напротив, короткие мРНК, кодирующие регуляторные белки не имеющие CRS, стабильны и транслируются.

В присутствии белка - продукта гена rev происходит “переключение”. Этот белок действует на последовательность CAR (от англ. cis-acting rev-responsive sequence), которая тоже содержится в длинных мРНК. При этом нейтрализуется CRS и начинают накапливаться полноразмерные мРНК, и вместо регуляторных белков синтезируются белки, из которых собираются новые вирионы. Таким образом , механизм с участием гена rev может определять переход от скрытой инфекции к активному размножению вируса.

Однако в ходе репликации взаимодействие между механизмами rev и tat может сдерживать размножение вируса, нейтрализуя друг друга. Продукт гена tat усиливает синтез самого себя и белка гена rev, тогда как продукт гена rev замедляет собственный синтез и синтез белка кодируемого геном tat. В результате устанавливается своего рода гомеостаз, характеризующийся постоянными уровнями белков, кодируемых генами tat и rev, и умеренным производством вирусных частиц. Ограниченная репликация позволяет вирусу воспроизводиться годами, не убивая зараженные клетки, поэтому такой тип генетической регуляции может быть адаптивным признаком ретровирусов, хозяевами которых являются виды с долгим временем жизни, такие как человек.

Помимо активатора (tat) и избирательного регулятора (rev) у HIV есть негативный регулятор. Который замедляет транскрипцию вирусного генома. Ген негативного регуляторного фактора, обозначаемый nef (от англ. negative-regulatory factor), возможно, определяет способность HIV прекращать размножение и переходить в состояние покоя.

Последовательность, являющаяся мишенью  белка - продукта гена nef, расположена в начале вирусного генома в длинном концевом повторе. Она называется негативным регуляторным элементом (NRE, от англ. negative- regulatory element). NRE подавляет транскрипцию даже сама по себе; если вирусный LTR, лишенный этой последовательности, ввести в незараженную клетку, он обеспечивает повышенный уровень транскрипции клеточных генов. Продукт гена nef усиливает эффект NRE. но каким образом он достигает этого загадка.

Сложные механизмы регуляции размножения HIV действуют не в изоляции: они  тесно связаны с метаболизмом клетки-хозяина. Начать с того, что  вирус использует клеточный аппарат  для транскрипции своих генов  и синтеза белков. В частности, клеточные факторы явно играют роль во вспышке репликации HIV, происходящей при участии гена tat, когда зараженная Т-клетка стимулируется антигеном. Особенности молекулярного “климата” клетки-хозяина также, вероятно, как-то влияют на скорость размножения вируса, которая различна в различных типах клетки.

Возможно, для связи клеточных  и вирусных процессов имеет значение связь клеточных белков с LTR в  начале вирусного генома. Последовательности в LTR определяют сайт инициации транскрипции вирусных генов - стартовую точку, в  которой начинается синтез мРНК. По крайней мере восемь белков, которые в норме участвуют в клеточной транскрипции, связываются с клеточной ДНК в сайте инициации транскрипции или рядом с ним. Они играют определенную роль в процессе транскрипции. Один из белков, который узнает инициаторные последовательности, играет специфическую роль в Т-клетках и других лимфоцитах. Этот белок активируется, когда лимфоцит стимулируется антигенами и начинает размножаться. Считается, что он способствует размножению клетки, усиливая транскрипцию. Как выяснилось, при стимуляции зараженных Т-клеток усиливается связывание этого белка с геномом провируса. Таким образом активация этого белка может быть одним из путей ускорения размножения HIV при стимуляции Т-клетки.

Вероятно, набор клеточных факторов, действующий на вирусный геном, варьирует  в зависимости как от условий, так и от типа клетки-хозяина. Некоторые клетки, находясь в состоянии покоя. Могут просто не иметь белков, необходимых для инициализации транскрипции, так что инфекция остается скрытой. В других клетках скорость размножения вируса может быть ограничена из-за низкой концентрации инициаторных факторов или из-за избытка белков, ингибирующих синтез мРНК. Таким образом, клетка-хозяин при помощи собственных факторов транскрипции создает молекулярное окружение, влияющее на регуляторные механизмы HIV. После того как в результате действия описанных выше механизмов началось производство вирусных частиц, в игру вступает последний ген. Этот ген, названный vif (от англ. virion infectivity factor - фактор инфекционности вириона), кодирует небольшой белок, который обнаруживается в цитоплазме зараженных клеток и вокруг них в межклеточной среде, а так же в свободных вирусных частицах. Белок - продукт гена vif каким-то образом усиливает способность отпочковавшегося вириона заражать другие клетки. У штаммов HIV с мутациями, инактивирующими vif, вирионы имеют нормальный вид, содержат полный набор РНК и ферментов, но заражают клетки намного менее эффективно. 
 
    3. Этапы заражения клетки вирусом СПИДа

Первый шаг любой вирусной инфекции - связывание вирусной частицы с  компонентом мембраны заражаемой клетки. Для HIV роль такого рецепторного компонента играет белок, называемый антигеном CD4. (Антиген - это молекулярная структура, которая узнается антителом. ) из этого следует, что распределение CD4 в организме должно соответствовать тропизму HIV, т. е. спектру клеток и тканей, поражаемых вирусом. Антиген CD4 встречается главным образом на лимфоцитах, называемых Т-4 хелперами, которые являются важным элементом иммунной системы, а так же на некоторых других клетках.

Как было установлено, связывание происходит, если CD4 взаимодействует с белком оболочки вируса gp120, который распределен  на внешней поверхности мембраны. Удалось определить специфические  фрагменты молекул CD4 и gp120, участвующие  в связывании. Эти результаты открывают  возможность двойной борьбы с HIV: препятствовать взаимодействию вируса с клеточным рецептором CD4 можно  блокируя сам рецептор или экранируя  вирусный белок gp120.

Вследствие поражения клеток крови, несущих антиген CD4, особенно Т-4 лимфоцитов, по его концентрации можно судить о зараженности СПИДом. В клеточных  культурах можно так же наблюдать  еще один весьма удобный для исследования признак заражения - образование  многоядерных синцитиев. Синцитий представляет собой гигантскую клетку, содержащую множество ядер внутри одной мембраны. Он формируется в результате слияния  клеток, зараженных HIV, со здоровыми  клетками, несущими молекулы рецептора.

Наиболее строгое доказательство такого механизма взаимодействия вируса с клеткой стал эксперимент, проведенный  в 1984 г. в Колумбийском университете США. Удалось перенести ген, кодирующий CD4, в клеткиHeLa- линию клеток раковой опухоли шейки матки. Эти клетки не содержат CD4 и в норме не заражаются HIV. Тогда как измененные клеткиHeLa, несущие CD4, могут быть заражены HIV, после чего они быстро сливаются в гигантские синцитии.

Этот эксперимент дал, кроме  того, один неожиданный результат, который  до сих пор полностью не объяснен. Человеческий ген CD4 был введен в  мышиные Т-клетки, которые тем  самым приобрели способность  производить соответствующий белок. Частицы HIV связывались с этими  измененными клетками, однако признаков  инфекции не было: не образовывался  ни синцитий, ни инфекционные вирусные частицы. Это было удивительно, так  как мышиные клетки вообще-то способны поддерживать размножение HIV при некоторых  условиях. По всей видимости, мышиные  клетки не могут быть заражены частицами HIV даже в присутствии рецепторов HIV. К заражению мышиных клеток оказались также неспособны некоторые  родственные вирусы. Эти факты  позволяют предполагать, что необходим  еще какой-то компонент клеточной  поверхности для того, чтобы вирус, прикрепившийся к клеточной мембране смог проникнуть внутрь клетки. Природа такого дополнительного фактора пока не ясна.

Связывание вирусного gp120 с клеточным CD4 - это только первый этап проникновения вируса в клетку. Последующие этапы пока менее понятны. Например, как попадает в клетку вирусный генетический материал? Простейшая и наиболее вероятная возможность состоит в том, что оболочка вириона сливается с клеточной мембраной и содержимое вирусной частицы (включая генетический материал) оказывается внутри клетки. Другой возможный путь - эндоцитоз, т. е. образование небольшого впячивания клеточной мембраны, которое затем отпочковывается внутрь, превращаясь в замкнутый мембранный пузырек. Пузырек полностью окружает вирусную частицу и переносит ее внутрь клетки. Там мембрана, образующая пузырек (теперь он называется эндосомой), закисляется. Это приводит к конформационным изменениям, слиянию ее с вирусной мембраной и освобождению содержимого вирусной частицы во внутриклеточное пространство.

Независимо от того, что на самом  деле происходит -прямое слияние или эндоцитоз - вирусная мембрана должна претерпеть слияние с клеточной. Как же это осуществляется? Согласно одной из гипотез, представляющейся вполне правдоподобной, связывание gp120 с CD4 вызывает изменение конформации белка gp120, вследствие чего обнажается часть другого белка оболочки, gp41, в норме скрытого под молекулой gp120. Эта область gp41 гидрофобна и потому должна внедряться в мембрану, а не оставаться снаружи, в водной среде, окружающей клетку. Оказавшись открытой, гидрофобная область gp41 взаимодействует с близлежащей частью клеточной мембраны и индуцирует ее слияние с вирусной мембраной. Пока не ясно, нужен ли для связывания с gp41 еще какой-то рецептор клеточной поверхности, помимо CD4, или же gp41 сам внедряется прямо в клеточную мембрану.

После того, как HIV проник в клеточную  среду и его генетический материал интегрировался в клеточный геном, он может оставаться неактивным и  никак себя не обнаруживать, а может  и проявиться одним из трех способов. Во-первых, вирусный геном может  вызвать персистирующую инфекцию; при этом образуется некоторое количество вирусных частиц, но клеток погибает немного. Во-вторых, инфекция может привести к образованию синцития, который вскоре гибнет. Появление синцитиев - главный результат воздействия HIV на культуру клеток. В организме зараженного человека синцитии иногда можно наблюдать на поздних стадиях инфекции *особенно в мозге). Неясно, однако, играют ли они какую-то роль в раннем патогенезе СПИДа.

Третий вероятный результат  заражения HIV - быстрая гибель клеток без образования синцитиев. Каким образом HIV убивает клетки пока не ясно. Возможно, какие-то из продуктов, кодируемых генами HIV, обладают прямым токсическим действием. Возможно, также разрушение клеточной мембранной системы из-за того, что внедрившийся в нее gp120, синтезированный в результате инфекции, взаимодействует с имеющимся в мембране CD4. Судьба зараженной клетки зависит и от иммунного ответа, поскольку иммунная система способна узнавать вирусные белки на поверхности зараженных клеток и убивать эти клетки. Распределение зараженных HIV клеток в организме обусловлено главным образом тем, как распределены клетки, несущие CD4. Изначально этот антиген был идентифицирован по его присутствию на определенных Т-лимфоцитах. И действительно, его нормальные функции, по-видимому, в основном связаны со сложной сетью взаимодействий между клетками иммунной системы. Т-лимфоциты, несущие CD4, способны взаимодействовать с клетками, представляющими антигены. Эти последние находят чужеродные антигены и экспонируют их на своей клеточной мембране вместе со специфическими белками гликопротеинамиMHC класса II (от англ. Major Histocompatibility Complex - главный комплекс гистосовместимости). Когда Т4-хелперы узнают комбинацию антигена и гликопротеинаMHC класса II, они инициируют иммунный ответ против чужеродных или зараженных клеток, несущих этот антиген. Считается, что взаимодействие между антигенами CD4 на Т-клетках и гликопротеинамиMHC класса II на клетках, представляющих антиген, важный элемент контакта этих клеток. Как сейчас известно, Т-лимфоциты не единственные клетки со встроенным в мембрану антигеном CD4. Не менее 40% моноцитов периферической крови (эти клетки являются предшественниками макрофагов - клеток-“мусорщиков”) и некоторые клетки, представляющие антиген в лимфатических узлах, коже и других органах, а также примерно 5% всех В-клеток организма (эти клетки производят антитела) несут CD4 и могут быть заражены HIV.

Но некоторые виды клеток заражаются HIV в культуре, а прямо выделить в них CD4 не удается. К ним относятся  глиальные клетки головного мозга, клетки ряда злокачественных опухолей мозга, а также определенные линии  клеток из раковых опухолей кишечника. Однако, хотя эти клетки и не производят CD4 в экспериментально определимых  количествах, они содержат немного  информационной РНК, кодирующей белок CD4, а значит, способны синтезировать  и сам CD4. По-видимому, для заражения HIV достаточно даже очень малого количества CD4. 
 
    4. Препараты, противостоящие СПИДу

Всякое терапевтическое средство против инфекции независимо от природы  патогена - будь то вирус, бактерия, грибок или простейшее - должно либо вызывать гибель патогена, либо прекращать его  размножение. При этом препарат не должен причинять существенного вреда  зараженному организму. Как правило, такие лекарства выполняют свою задачу, действуя на биохимические  процессы, характерные только для  патогена. В случае бактерий это  достигается сравнительно просто, так как по структуре и метаболизму клетки бактерий и клетки организма млекопитающего сильно различаются. Например, пенициллин нарушает синтез клеточной стенки бактерий, а на клетки млекопитающих, у которых нет такой стенки, он не действует.

С вирусами ситуация гораздо сложнее. Вирусы представляют собой просто генетический материал, одетый в оболочку из гликопротеинов и липидов. Они не способны размножаться самостоятельно и вместо этого заражают клетки другого организма и узурпируют их аппарат биосинтеза, который и  обеспечивает воспроизведение вируса. Когда происходит активная репликация вируса, часто бывает трудно различить  вирусные белки, взаимодействующие  с клеткой и белки самой  клетки. Тесная связь многих этапов жизненного цикла вируса с метаболизмом клетки-хозяина затрудняет создание препаратов, которые избирательно подавляют  репликацию вируса и в тоже время  минимально воздействуют на клетку. Существенно также, что практически любой препарат (в том числе и пенициллин) обладает в той или иной степени побочным действием и токсичностью. Поэтому всегда необходимо учитывать не только эффект воздействия на патоген, но и вред, причиняемый организму человека. Важнейшей характеристикой потенциального терапевтического препарата является его “терапевтический индекс”: отношение токсичной дозы к эффективной дозе. Однако в случае болезней , представляющих угрозу для жизни, таких как СПИД, допустимо использовать и препараты со сравнительно низкими значениями терапевтического индекса по меньшей мере, пока не созданы более совершенные.