Трансплантация незрелой нервной ткани

Трансплантация клеток незрелой нервной ткани представляется весьма перспективным методом лечения  неврологических расстройств, поскольку  сочетает в себе оба вышеупомянутых подхода. В действительности, установлено, что такая клеточная трансплантация, с одной стороны, может создавать  микроокружение благоприятное для  аксонального роста, а с другой стороны, обеспечивать замещение поврежденных нейронов функционально полноценными донорскими клетками. Как и в отечественной практике отношение к нейротрансплантации так и, до сих пор остается весьма настороженным.

Трансплантаты незрелой нервной  ткани, оказывая на мозг реципиента прямое (как специфическое, так и неспецифическое) воздействие, добавляют содержащиеся в них функционально активные вещества (медиаторы, гормоны, факторы роста, противовоспалительные вещества и т.д.), находящие соответствующие мишени в мозге, или захватывают избыток веществ из окружающих тканей. На ранних этапах после введения прямое воздействие обусловлено химическим составом трансплантата или способностью его клеток захватывать избыток определенных веществ. На поздних этапах, когда трансплантат образует как нервные, так и гуморальные связи с мозгом реципиента, и клетки трансплантата сами становятся продуцентами физиологически активных факторов, то прямое воздействие обусловливается функциональной активностью нейротрансплантата. При этом неспецифическое воздействие ослабляется, так как незрелая ткань, богатая разнообразными факторами, с возрастом утрачивает первоначальное свое значение. В то же время специфическое воздействие сохраняется и усиливается по мере того, как трансплантат развивается, синтезирует необходимые вещества и поставляет их в мозг реципиента.

Трансплантация клеток незрелой нервной ткани используемая для  лечения травматической комы после  тяжелой закрытой черепно-мозговой травмы (ЗЧМТ). Источником клеток являются плоды 15-20-недельной гестации. Криоконсервация клеток проводится с максимальным сохранением жизнеспособности. Материал хранится в жидком азоте при температуре -196°С. Клеточная суспензия формируется из мозга 3 плодов и включает в себя клетки нервной ткани и печени в соотношении 10:1.

Материал аттестуется  согласно международным стандартам оценки на инфицированность используемых для трансплантации тканей:

- исследование сыворотки  крови донора фетального материала  на наличие антител против  ВИЧ, гепатита С, сифилиса (кардиолипинового  антигена) и Hbs-антигена вируса  гепатита В двумя разными тест-системами; 

- исследование соскоба  эпителиальных клеток цервикального  канала донора и суспензии  клеток крови, почек, легкого  и мозга абортного плода на наличие геномной ДНК вируса герпеса, цитомегалии и хламидий с использованием метода полимеразной цепной реакции.

Трансплантация проводится после стабилизации витальных функций  и купировании отека мозга, что  подтверждается данными объективного, лабораторного, функционального и  инструментального исследования, включая  компьютерную магнитно-резонансную  томографию (МРТ). Аттестованный трансплантационный материал доставляется из Института  клинической иммунологии СО РАМН (г. Новосибирск).

Транслюмбальная нейротрансплантация выполняется с помощью поясничного прокола между LIII-LIY позвонками под местной анестезией 0,5% раствором (5-6 мл) новокаина (при непереносимости - 5 мг седуксена внутривенно и местная анестезия хлорэтиловым орошением). За 1 час до поясничного прокола внутримышечно вводится 8-12 мг дексазона в качестве иммуномодулятора. Забирается 5-6 мл ликвора для анализа, взамен его в адекватном объеме стерильного изотонического раствора хлорида натрия вводится суспензия клеток незрелой нервной ткани (450-500 миллионов).

После транслюмбальной нейротрансплантации в течение 1-2 суток наблюдается пирогенная реакция в виде субфебрилитета от +37,1 до +37,8?С, что требует проведения термометрии в течение 2-3 суток через каждые 3 ч. При плохой переносимости подъема температуры тела внутримышечно однократно или двукратно вводится 2 мл 50% раствора анальгина с 2 мл тавегила. При психоэмоциональной лабильности в течение 2-3 дней до и 5-7 дней после нейротрансплантации проводится 7-10-дневный курс терапии транквилизаторами и антидепрессантами.

Актуальность  проблемы.

Нейротрансплантация занимает особое место в проблеме пересадки органов и ткани. С помощью внутримозговой трансплантации незрелой нервной ткани или культуры нервных клеток можно исследовать фундаментальные проблемы развития и функционирования мозга, а при клиническом применении нормализовать многие нарушенные функции организма.

Первые исследования по трансплантации нервной ткани в мозг были начаты еще в конце XIX века. Но только в 70-е  годы XX столетия началось развитие нейротрансплантологии как самостоятельного научного направления. Именно в эти годы окончательно подтверждается и обосновывается обнаруженный ранее факт (Dunn, 1917; Le Gros Clark, 1940 и др.) более успешного приживления незрелой нервной ткани, выделенной из мозга эмбрионов, новорожденных или молодых животных.

Основная задача, стоявшая перед экспериментаторами, заключалась  в изучении возможностей использования  трансплантата развивающейся нервной  ткани как функционально-структурного аналога поврежденной или удаленной  структуры мозга взрослого организма. Однако, в ряде работ было показано, что при нейротрансплантации не происходит полного и точного восстановления нарушенных связей между трансплантатом и мозгом реципиента и нормальной иннервации структур-мишений (Freed, 1985; Herman etal., 1986).

В настоящее время уделяется  внимание трем направлениям в изучении компенсаторно-восстановительных процессов  в результате трансплантации незрелой нервной ткани: первое направление  связано с установлением трансплантатом связей с мозгом реципиента и включение  его в общую систему функционирования; второе - с восполнением нейрохимического дефицита за счет установления связей с определенной областью мозга реципиента и третье - со стимулированием трансплантированной  тканью компенсаторно-восстановительных  процессов в мозге реципиента на ранних сроках после ее введения, в первую очередь, посредством диффузного выделения и распространения  физиологически активных веществ трансплантата (Bjorklund et al., 1981; Labbe et al., Stein et al., 1983; Виноградова, 1984; Полежаев, Александрова 1986; Cotman и Kesslak, 1988). Наиболее изученными являются первые два направления, исследующие воздействие трансплантированной ткани на мозг реципиента после образования связей между трансплантатом и мозгом реципиента, как правило, через 2-3 месяца после операции (Полежаев, Александрова, 1986; Bjorklund et al., 1987; Cotman and Kesslak, 1988; Брагин, 1990; Dunnett, Bjorklund, 1994; Stein, Glasier, 1995; Smden et al., 1995; Журавлева, 1999; Лосева, 1999, 2001; Александрова, 2000). Эти два направления можно условно отнести к изучению поздних этапов развития трансплантата в мозге реципиента. Ряд заболеваний связывают с дефицитом определенных нейромедиаторов и/или гормонов. В связи с этим основное внимание большинства экспериментаторов было направлено на изучение нормализации нарушенных функций в результате восполнения трансплантатом недостатка соответствующих химических веществ в поздние сроки (не ранее, чем через 2-3 месяца) после введения ткани в поврежденные или разрушенные области мозга (Bjorklund, Gage, 1985; Семенова и др., 1988, 1990; Угрюмов, 1989; Брагин, 1990; Dunnett, 1991).

Однако, наблюдаемое через  несколько месяцев восстановление нарушенного поведения могло  являться результатом влияния донорской  ткани на мозг реципиента уже на ранних сроках после ее трансплантации (первые три-четыре недели). К тому же по данным D.G.Stein (1987), если в мозге реципиента под влиянием нейротрансплантации произошли определенные изменения, то даже удаление трансплантатов не останавливает начавшиеся компенсаторно-восстановительные процессы, что подчеркивает важность и значимость именно ранних эффектов нейротрансплантации. В нескольких работах была описана нормализация нарушенного поведения животных через несколько дней после введения ткани (Labbe et al., 1983; Stein et al., 1983; Ермакова, Лущекина, 1984; Dunnett et al., 1987). Однако, характер подобного воздействия трансплантата оставался неисследованным. Полученные ранние эффекты нейротрансплантации при отсутствии связей между трансплантатом и мозгом реципиента были объяснены исключительно действием нейротрофических факторов, которые, как было показано рядом авторов, способствуют выживанию нейронов, образованию новых связей, активации «молчащих» клеток, стимуляции спонтанных процессов восстановления и др. (Виноградова, 1984, 2000; Cotman, Kesslak, 1988; Полежаев, Александрова, 1986; Rennert, Henrich 1986; Stein, Mufson, 1987; Dunnett, Bjorklund, 1994).

Внутримозговая трансплантация развивающейся нервной ткани  вызывает интерес и у клиницистов  в плане использования ее для  восстановления нарушенных функций человека, вызванных повреждением головного или спинного мозга. Обнаруженное исследователями благотворное нейрохимическое (и, в первую очередь, трофическое и медиаторное) воздействие трансплантатов незрелой нервной ткани на поврежденный мозг позволило приступить к использованию абортивного материала в клинике для лечения черепно-мозговых травм, детского церебрального паралича, шизофрении, болезни Паркинсона, эпилепсии, диабета, болезни Альцгеймера и других (Tsymbaliuk et al., 1989; Lindvall et al., 1992; Widner et al., 1992; Freed, 1993; Rasskazov et al., 1994; Семченко и др., 1996; Берснев и др., 1998; Миронов и др., 1998; Кулаков и др., 1998; Сухих и др., 1998 и др.). Однако, только в небольшом проценте случаев наблюдается выздоровление больных. При тяжелых формах заболевания лечебный эффект нейротрансплантации является кратковременным, достигнутые успехи в лечении сочетаются с неудачами, что говорит об отсутствии определенных знаний о характере взаимодействия пересаженной ткани с мозгом реципиента как на ранних, так и на поздних этапах развития трансплантатов.

Практически не изучены механизмы  влияния нейротрансплантатов на функциональное состояние организма, особенно на ранних сроках после введения донорской ткани в мозг реципиента. Не получены окончательные ответы на вопросы о зависимости позитивного эффекта от характера и степени повреждения мозга реципиента, формы изучаемого поведения и многих других факторов. Практически не исследуются условия, при которых могут наблюдаться негативные влияния нейротрансплантатов на мозг реципиента.

Еще одна важная проблема, которая  находится вне поля зрения большинства  исследователей, связана с использованием трансплантата для воздействия  на мозг реципиента с целью изучения механизмов работы нормального и  патологически измененного мозга. При этом большое значение имеют  не только нейрохимическая природа  трансплантированной ткани и  состояние мозга реципиента, но и  характер изучаемой формы поведения.

При трансплантации ткани  незрелого мозга в патологически  измененный мозг реципиента может наблюдаться  как нормализация нарушенных функций, так и отсутствие восстановления или даже усиление нарушений поведения. Нарушение поведения выявляется и при трансплантации в интактный мозг.

Позитивный эффект нейротрансплантации наблюдался при небольших повреждениях той или иной структуры (например, вызванное проколом механическое повреждение структуры, односторонняя электрокоагуляция, нейрохимическое разрушение части структуры и др.) или при нарушении нейромедиаторной системы (инъекция каиновой кислоты,аудиогенные судороги). При этом восстановление поведения возможно уже на ранних сроках трансплантации и обусловлено нейрохимическим взаимодействием трансплантата и мозга реципиента. Наши эксперименты показывают возможность неспецифического и специфического влияния нейротрансплантатов уже в первые дни после имплантации. Было выдвинуто предположение, что неспецифическое воздействие нейротрансплантатов может быть обусловлено действием трофических факторов, специфическое - действием нейромедиаторов, пептидов, гормонов и других. Поскольку влияние трансплантированной ткани наблюдалось нами в первые дни после трансплантации при отсутствии связей между трансплантатом и мозгом реципиента, то механизм действия трансплантатов был связан с диффузным распространением биологически активных веществ по межклеточным пространствам.

Восстановление нарушенного  поведения наблюдалось как при  трансплантации в мозг реципиентов  кусочков ткани незрелого мозга  и нейроглиальных агрегатов, так  и культуры астроцитов. Предполагается, что астроглиальные трансплантаты могут не только являться источником нейротрофических факторов и нейромедиаторов, но и способны поглощать избыток определенных веществ (например, возбуждающих нейромедиаторов).

Негативное влияние нейротрансплантации наблюдалось при имплантации ткани либо в интактный мозг, либо на место удаленной или полностью разрушенной специфической области мозга (в нашем случае, обонятельных луковиц).

На основе литературных и  собственных данных можно сделать  заключение, что трансплантаты, с  одной стороны, могут являться источником физиологически активных веществ (нейротрофических факторов, нейромедиаторов, гормонов и др.), с другой - способны непосредственно влиять на мозг реципиента, оказывая модулирующее, стимулирующее или тормозное воздействие, способствуя синтезу разных веществ (нейротрофических факторов, гормонов, нейротрансмиттеров, пептидов и других), активируя транскрипцию ранних и поздних генов или стимулируя миграцию стволовых клеток и образование новых клеток в мозге реципиента.

Таким образом, характер влияния  нейротрансплантации двоякий: с одной стороны, трансплантаты активируют или затормаживают процессы в мозге реципиента, с другой - являются источником физиологически активных веществ, восполняя их дефицит в мозге или стимулируя компенсаторно-восстановительные процессы.

Нейротрансплантация открывает большие возможности как для изучения восстановления нарушенных функций и усиления компенсаторно-восстановительных процессов в патологически измененном мозге, так и для исследования механизмов работы нормального и патологически измененного мозга.

Концепция о влиянии  нейротрансплантатов на мозг реципиентов

Анализ литературных данных и собственных результатов позволил нам предложить в 2001 году концепцию о воздействии нейротрансплантатов различного генеза на мозг реципиентов [Лосева, 2001]. В незрелой нервной ткани содержатся как неспецифические факторы (противовоспалительные, ростовые, иммуносупрессорные и т.д.), характерные для всего развивающегося мозга, так и специфические вещества (нейромедиаторы, нейропептиды, ферменты, гормоны и др.), свойственные определенным структурам мозга и играющие важную роль в процессах дифференцировки и развития тканей и клеток этих структур. Исходя из этого нейротрансплантаты, попадая в мозг реципиента, могут оказывать на него как неспецифическое, так и специфическое воздействие. Неспецифическое и специфическое воздействие нейротрансплантатов может быть как прямым, так и модулирующим (деление условно). Если для нейротрансплантации используется менее зрелая ткань, то выделенные из нее трансплантаты оказывают на мозг реципиента, особенно в первое время после введения, главным образом неспецифическое воздействие, связанное с содержащимся в ней комплексом веществ, способствующих процессам регенерации, тормозящих воспалительные реакции и т.д. Наличие таких факторов в эмбрионе на ранних этапах развития препятствует его отторжению из организма матери. Трансплантаты, полученные из более зрелой нервной ткани, могут оказывать на мозг в большей степени специфическое влияние. Это связано с наличием в такой ткани, наряду с неспецифическими факторами, веществ, которые в период развития плода должны способствовать процессам дифференцировки структур и клеток мозга, а также стимулировать синтез нейромедиаторов в соотношениях, специфических для конкретных мозговых образований. Попадая из незрелого трансплантата в мозг реципиента, неспецифические факторы могут ускорять заживление ран, тормозить воспалительные процессы и отторжение трансплантатов и так далее. Специфические факторы, влияя непосредственно на уже дифференцированные клетки в мозге реципиента, могут стимулировать синтез определенных нейромедиаторов и белков, способствовать образованию и созреванию новых активных рецепторов и других клеточных элементов (например, синапсов),