Протеолитическая активность катепсинов мышечной ткани

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА  И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

УО «ГГАУ»

 

 

 

 

 

 

 

КСР на тему:

 

«Протеолитическая активность катепсинов мышечной ткани»

 

 

 

                                                

 

 

 

 

 

 

 

       

 

                                                          Выполнила:

 

 

Гродно 2012

СОДЕРЖАНИЕ:

1. Ведение……………………………………………………3

2. Метод Ансона в модификации Е. Каверзневой……….4

3. Список используемой литературы…………………...….7

 

   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1.Введение.

После убоя животного прекращается обмен веществ и приток кислорода  к клеткам тканей. В мясе происходят биохимические процессы: изменяются белковые вещества, обусловливающие  изменение нежности мяса, экстрактивные  вещества, вызывающие образование и  накопление продуктов, которые влияют на вкус и аромат.

Прижизненная роль внутриклеточных  протеолитических ферментов многогранна: они участвуют в катаболизме  белков и доставке пластического  материала для биосинтетических реакций, в образовании и распаде  физиологически активных веществ, оказывают  прямое воздействие на энзиматический аппарат клетки посредством активации зимогенов или протеолитической модификации самих ферментов и т. д.

В автолитических превращениях мышечной ткани наиболее важное значение имеет деятельность двух основных ферментных систем. Одна из них связана с функцией движения, другая – катализирует непрерывный распад главных структурных элементов мышечного волокна, в том числе актомиозинового комплекса. Главная роль отводится катепсинам. 

Изменения в мясе после убоя животного  и при хранении вызываются действием  тканевых ферментов. Автолитическими процессами называют процессы распада компонентов тканей под влиянием находящихся в них ферментов. После разрешения посмертного окоченения в мясе происходят изменения, называемые «созреванием» мяса. Катепсины – кислые протеиназы – проявляют максимальную активность при рН 2,0 – 5,0. Они находятся в органах, тканях и локализованы в лизосомах, которые представляют собой внутриклеточные пузырьки диаметром около 5,5 мкм, ограниченные мембраной.

Катепсины являются типичными протеиназами и вызывают деструкцию высокомолекулярных белков. С деятельностью катепсинов, которые во втором периоде автолиза освобождаются из лизосом и активируются кислой реакцией среды клетки, тесно связаны изменения свойств белков, предшествующие релаксации мышц. Эти биохимические изменения можно разделить на две группы:

1. Изменения экстрактивных соединений, формирующие вкус и запах мяса в желательном направлении, особенно заметные после термообработки.

2. Изменения белковой фракции, которые начинаются с изменения гистологической структуры, консистенции, цвета, способности к гидратации и других качественных показателей.

Здесь играют роль дыхательные ферменты, инактивируемые в результате прекращения  дыхания и гидролитические, устойчивые к химическим изменениям среды, связанным  с прекращением жизни животного.

Роль оксидаз постепенно снижается  из-за возрастающего недостатка кислорода, т.е. в начале созревания в активном состоянии сохраняются ферменты, катализирующие прежде всего гидролиз гликогена (первая фаза созревания). Затем, по мере снижения его содержания в результате действия амилазы и мальтазы, доминируют ферменты, обладающие активностью при рН = 6,8-7,2. По мере дальнейшего снижения кислотности (рН = 5) возрастает активность протеолитических ферментов (вторая фаза созревания). Эти ферменты не доминируют при жизни животного, зато они участвуют в протеолизе мяса, катализируя все реакции, которые протекают в анаэробных условиях и вызывают изменения азотсодержащих веществ мяса.

Катепсины А, В и С мышечной ткани отличаются тем, что оптимальные условия для их воздействия создаются при низком значении рН, индивидуальном для разных субстратов, на которые они воздействуют.

Действуя на разные субстратные  фрагменты, катепсины оказывают существенное влияние на структуру белковых компонентов. Это вносит определённый вклад в диссоциацию образовавшихся на этапе посмертного окоченения белковых агрегатов, ведёт к появлению свободных сульфгидрильных групп и частичному восстановлению свойств мышечной ткани, утраченных в процессе окоченения.

В результате действия катепсинов на белки при правильном развитии автолитических процессов мясо приобретает нежность, сочность, выраженный вкус и аромат. Характер и глубина автолитических изменений в мясе влияют на его качество и пищевую ценность.

Изучение и целенаправленное использование  биохимических свойств тканевых ферментных систем необходимы для регулирования и интенсификации технологических процессов получения свежего мяса и продуктов его переработки.

При получении продуктов с заданными  свойствами управление технологическими процессами осуществляется путём воздействия  на основные ферментные системы мяса внешних факторов: температуры, рН среды  и т. д., для чего необходимо знать условия проявления активности катепсинов.

 

2.Метод Ансона в модификации Е. Каверзневой

 

Сущность метода состоит в определении каталитических свойств по степени расщепления стандартных белков с образованием низкомолекулярных продуктов: пептидов и аминокислот, в частности, по накоплению тирозина.

За единицу протеолитической активности (ПА) принято количество фермента, которое  за 1 мин при 30ºС катализирует переход в неосаждаемое трихлоруксусной кислотой  (ТХУ) состояние такого количества субстрата, которое содержит 1 мкмоль тирозина(1,181 мг).

Протеолитическая активность экстракта  катепсинов выражается числом протеолитических единиц в 1 см³ ферментного раствора (ед/см³)Метод определения протеолитической активности может также успешно применяться и при анализе пищеварительных ферментов: пепсина, панкреатина, химотрипсина и брипсина.

Подготовка проб. Мышечную ткань очищают от жировой и соединительной тканей, измельчают сначала на мясорубке, а затем гомогенизируют. Навеску измельченного сырья смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1:20 и экстрагируют при (20+-5) ºС припереодическом перемешивании смеси в течение 30 мин. Затем смесь фильтруют через бумажный фильтр, фильтрат используют в качестве вытяжки протеолитических ферментов – катепсинов.

Техника определения.

Субстрат ( раствор казеината натрия или гемоглобина массовой долей 2% с заданным значение pH ) объемом 2 см³ помещают в пробирку, прогревают до нужной температуры и прибавляют 2 см³ исследуемого экстракта протеолитических ферментов мышечной ткани. При этом фиксируют время внесения экстракта. Смесь выдерживают в течение 15 мин, а затем добавляют 4 см³ раствора ТХУ массовой долей 2%, встряхивают и выдерживают 20 мин (количество вносимого фермента рассчитывают так, чтобы в смеси присутствовал избыток субстрата).

Параллельно с опытной готовят  контрольную пробу, смешивая реактивы в обратной последовательности. Для этого в контрольную пробирку помещают 2 см³ ферментной вытяжки, добавляют 4 см³ раствора ТХУ массовой долей 2%, встряхивают и выдерживают 15 мин. Затем добавляют еще 2 см³ субстрата, встряхивают и выдерживают 20 мин при заданной температуре.

Реакционные среды (контроль и опыт) фильтруют через бумажный фильтр. В чистые пробирки отбирают по 1 см³ прозрачного фильтрата и 5 см³ раствора NaCO₃, молярной концентрацией 0,5 моль\дм³ и 1 см³ рабочего раствора реактива Фолина. Смесь встряхивают и выдерживают 20 мин. После этого окрашенный раствор фотоколориметрируют против контроля при длине волны 670 нм с красным светофильтром в кюветах с толщиной светопоглощающего слоя 10 мм.

Протеолитическая активность (ед/ см³): ПА=(4DK)/(ТЭ∙Т),

где D – оптическая плотность раствора; К – степень разведения; ТЭ – тирозиновый эквивалент, определяемый по калибровочному графику для данного реактива Фолина; Т – продолжительность гидролиза, мин; Т=15 мин.

Построение калибровочного графика.

 Для расчета протеолитической активности строят калибровочный график по тирозину, по которому затем вычисляют тирозиновый эквивалент, т. Е. ту оптическую плотность, которая соответствуют 1мкмоль тирозина в 1 см³ стандартного раствора. ТЭ необходимо устанавливать для каждой новой партии раектива Фолина и каждого фотоэлектроколориметра.

Готовят раствор тирозина молярной концентрацией 10^-3 моль/дм³, для чего 181,19 чистого тирозина растворяют в растворе HCl молярной концентрацией 0,2 моль/дм³ в мерной колбе вместимостью 1 дм³ (готовят 2 параллельные пробы). Исходный раствор тирозина используют для приготовления дальнейших разведений в соответствии с приведенными ниже рекомендациями, для чего в мерную колбу вместимостью 50 см³ вносят от 1 до 15 см³ исходного раствора тирозина и объем доводят до метки раствором HCl молярной концентрацией 0,2 моль/дм³:

Объем исх. р-ра тирозина, см3	Объем р-ра HCl молярной концентрацией 0,2 моль/дм3	Концентрация тирозина
		моль/дм3   ( 10-4)	мкмоль/см3
1	49	0,2	0,02
2	48	0,4	0,04
4	46	0,8	0,08
5	45	1	0,1
7,5	42	1,5	0,15
10	40	2	0,2
15	35	3	0,3

Затем в пробирки вносят по 1 см³ раствора тирозина разных концентраций. Добавляют в них при постоянном помешивании по 0,5 см³ раствор карбоната натрия молярной концентрацией 0,5 моль/дм³ и 1 см³ рабочего раствора реактива Фолина. Контрольный опыт готовят точно также, но вместо раствора тирозина берут 1 см³ дист-ной воды. Дают реакционной смеси постоять 20 мин.

Интенсивность окраски опытного раствора измеряют по отношению  к контрольному при длине волны 656-670 нм в кюветах с толщиной светопоглощающего слоя 10 мм. По средним данным, полученным из двух опытов, строят калибровочный график. На оси абсцисс откладывают количество тирозина (мкмоль/см³), на оси ординат – соответствующие значения оптической плотности D.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3.Список используемой литературы:

 

1. Л.В. Антипова, И.А. Глотова, И.А. Рогов «Методы исследования мяса и мясных продуктов». С.288 - 292.