Биоиндикационная оценка реки Карасуль

Среди животных на клеточном уровне организации  наиболее важное индикаторное значение имеют дафнии. Преимущество перед другими группами беспозвоночных (саркодовые и жгутиконосцы) они имеют потому, что видовой состав и численность их наиболее четко соответствуют каждому уровню сапробности среды, они отличаются высокой чувствительностью к изменениям внешней среды и отчетливо выраженной реакцией на эти изменения, имеют относительно крупные размеры и быстро размножаются. Используя эти особенности дафний, можно с известной степенью точности установить уровень сапробности водной среды, не привлекая для этой цели другие индикторные организмы(Розенберг.,1994).

Методическое  руководство по биотестированию  воды разработано с целью обеспечения  сотрудников лабораторий системы  Госкомприроды СССР, республиканских  и местных комитетов по охране природы, других министерств и ведомств пособием для проведения токсикологического контроля сточных и природных вод методами биотестирования.

В соответствии с п. 5.7 и Приложением № 1 Правил охраны поверхностных вод (1991 г.), биотестирование  является обязательным элементом системы  оценки и контроля качества воды.

Методическое  руководство включает методики биотестирования  с использованием в качестве тест-объектов ракообразных, водорослей и рыб.

Биотестирование проводят для определения токсичности  сточной воды на сбросе в водный объект, воды в контрольном и других створах водопользования с целью проверки соответствия качества воды нормативным требованиям: сточная вода на сбросе не должна оказывать острого токсического действия, а вода в контрольном и других створах водопользования - хронического токсического действия на тест-объекты.

Результаты  биотестирования учитывают при  установлении величин предельно  допустимых сбросов (ПДС) загрязняющих веществ.

Наличие острого  токсического действия сточной воды на сбросе в водный объект определяют при кратковременном биотестировании на ракообразных (дафниях или цериодафниях).

Наличие хронического токсического действия сточной природной  воды в контрольном и других створах  водного объекта определяют при  длительном биотестировании на ракообразных (дафниях или цериодафниях).

Для более детальной  токсикологической оценки сточной  и природной воды биотестирование  должно вестись минимум на двух объектах параллельно. Один объект должен относиться к фитопланктону (хлорелла или сцередесмус), другой - к зоопланктону (дафния магна или цериодафния). Предпочтительнее тестировать на хлорелле и цериодафнии, как на более чувствительных объектах.

Пробы сточной  воды для биотестирования отбирают, руководствуясь инструкцией по отбору проб для анализа сточных вод  НВН 33-5.3.01-85(14); отраслевыми стандартами или другими нормативными документами. Пробы природной воды отбирают, руководствуясь, ГОСТ 17.1.5.05-85(15).

Биотестирование проб воды проводят не позднее 6 ч после  их отбора. Если указанный срок не может  быть соблюден, пробы хранят до двух недель с открытой крышкой внизу холодильника (при +4°С). Не допускается консервирование проб с помощью химических консервантов. Перед биотестированием пробы фильтруют через фильтровальную бумагу с размером пор 3,5-10 мкм.

При определении  наличия острого и хронического токсического действия воду тестируют без разбавлении. Для учета результатов биотестирования при установлении величин ПДС и определения степени токсичности сточной и природной воды готовят серию разбавлении.

Для контроля (вода без токсических веществ) и разбавлении используют водопроводную воду, которую дехлорируют путем отстаивания и аэрирования с помощью микрокомпрессоров в течение семи суток. В тех случаях, когда результаты биотестирования учитывают при установлении величин ПДС, в качестве контрольной и разбавляющей служит природная вода, отобранная вне зоны влияния источника загрязнения и отфильтрованная через фильтровальную бумагу.

Если отсутствует  возможность отбора проб из контрольного створа, тестируют сточную воду на сбросе в водный объект в разбавлении, соответствующем таковому в контрольном створе.

Методика основана на определении изменений выживаемости и плодовитости дафний при воздействии  токсических веществ, содержащихся в тестируемой воде по сравнению  с контролем.

Кратковременное биотестирование - до 96 ч - позволяет определить острое токсическое действие воды на дафний по их выживаемости. Показателем выживаемости служит среднее количество тест-объектов, выживших в тестируемой воде или в контроле за определенное время. Критерием токсичности является гибель 50 и более процентов дафний за период времени до 96 ч в тестируемой воде по сравнению с контролем.

Длительное  биотестирование - 20 и более суток - позволяет определить хроническое  токсическое действие воды на дафний по снижению их выживаемости и плодовитости. Показателем выживаемости служит среднее количество исходных самок дафний, выживших в течение биотестирования, показателем плодовитости - среднее количество молоди, выметанной в течение биотестирования, в пересчете на одну выжившую исходную самку. Критерием токсичности является достоверное отличие от контроля показателя выживаемости или плодовитости дафний.

В качестве тест-объекта  используют Daphnia magna Straus.

Дафнии обитают  в стоячих и слабопроточных водоемах. На территории России дафнии широко распространены. Являются типичными мезосапробами, переносят осолонение до 6‰.

Рост дафний в течение всей жизни неравномерный, с возрастом замедляется и связан с периодическими линьками; первые три - ювенильные - следуют через 20, 24, 36 ч, четвертая - созревание яиц в яичнике - и пятая-откладывание яиц в выводковую камеру - следуют с интервалом 24-36 ч. Начиная с шестой, каждая линька сопровождается откладыванием яиц. Растет дафния наиболее интенсивно в первые дни после рождения. При хорошем питании размеры молодых дафний после каждой линьки удваиваются. Выметанная молодь имеет 0,7-0,9 мм в длину, к моменту половозрелости самки достигают 2,2-2,4 мм, самцы 2,0-2,1мм.

В природе в  летнее время, а в лаборатории  при благоприятных условиях круглый  год дафнии размножаются без оплодотворения - партеногенетически, причем рождаются  в большинстве самки. При резком изменении условий существования (недостаток пищи, перенаселенность, понижение температуры и т.д.) в популяции дафний появляются самцы и дафнии переходят к половому размножению, откладывая после оплодотворения «зимние яйца» (1-2 шт.), которые падают на дно водоема, где проходят стадию покоя. Весной из яиц появляются самки, которые в дальнейшем дают партеногенетические поколения дафний. Период созревания рачков при оптимальной температуре (20±2°С) и хорошем питании 5-8 суток. Наступление половозрелости отмечают по моменту выхода яйцеклеток в выводковую камеру. Длительность эмбрионального развития обычно 3-4 суток, а при повышении температуры до 25°С - 46 ч вывод молоди идет через каждые 3-4 суток. Число яиц в кладке увеличивается от 10-15 (в первых пометах) до 30-40 и более (у самок среднего возраста), а затем снижается (по мере старения) до 3-8. В лабораторных условиях продолжительность жизни дафний 3-4 мес. и больше.

Исходный материал для лабораторной культуры дафний можно  получить в ЦСИАК Уральского краевого комитета по экологии и природопользованию.

Заранее подготовленные стеклянные сосуды емкостью 3-5 л заполняют  на 1/3 объема отфильтрованной природной  водой и в них переносят  дафний с помощью стеклянной трубки (внутренний диаметр 0,5-0,7 см) с оплавленным  или опиленным надфилем концом, чтобы не травмировать рачков. Такую трубку используют и в дальнейшем при пересадке дафний. Начальная плотность посадки 6 - 10 особей на 1 л воды.

Культуру дафний выращивают в климатостате, люминостате, боксе или помещении, не содержащем токсических паров или газов. Оптимальная температура для культивирования дафний и биотестирования составляет 20±2°С, освещенность 400-600 лк при продолжительности светового дня 12-14 ч. Не допускают освещения дафний прямыми солнечными лучами. Стеклянную посуду для содержания дафний моют питьевой водой, хромовой смесью или соляной кислотой. Нельзя использовать для мытья синтетические моющие средства и органические растворители. В помещении, где находятся дафнии, не проводят обработку инсектицидами, не хранят летучие вещества и не работают с ними. Для культивирования дафний используют водопроводную воду, которую отстаивают и насыщают кислородом с помощью микрокомпрессоров не менее 7 суток. Используют также природную или аквариумную воду, отфильтрованную через бумажный фильтр. Вода для культивирования должна удовлетворять следующим требованиям: рН 7,0-8,2; жесткость общая 3-4 мг-экв/л, концентрация растворенного кислорода не менее 6,0 мг/л, солевой состав до 6 ‰.

Оптимальная плотность  культуры - 25 половозрелых самок в 1 л воды. Раз в 7-10 суток половину объема воды в сосуде с культурой дафний заменяют на свежую, удаляют сифоном скопившийся на дне осадок и при большой плотности культуры ее прореживают. Не рекомендуется аэрировать воду в сосудах с дафниями.

Кормом для дафний служат зеленые водоросли (хлорелла или сценедесмус) и хлебопекарные дрожжи. Культуру зеленых водорослей выращивают на одной из искусственных питательных средах, которые готовят на дистиллированной воде. Навеску каждого вещества растворяют в небольшом количестве воды, а затем растворы сливают вместе в порядке расположения реактивов   (чтобы избежать, осадка) и доливают воду до соответствующего объема. Готовят два раствора микроэлементов отдельно (А3 и В2) и вносят их по 1 мл на 1 л среды. Среду Тамия перед посевом водорослей разбавляют дистиллированной водой в 3-5 раз.

Посев водорослей производят альгологически чистой культурой, которую выращивают в стерильных условиях. Культуру водорослей вносят в питательную среду в количестве, дающем светло-зеленое окрашивание. Исходная концентрация около 2 тыс. кл/мл.

Культивируют  водоросли в стеклянных кюветах, батарейных стаканах или плоскодонных колбах при круглосуточном освещении  лампами дневного света 3000 лк и постоянном продувании культуры воздухом с помощью микрокомпрессоров. Через 7-10 суток, когда окраска культуры водорослей становится интенсивно зеленой, их отделяют от питательной среды путем центрифугирования или отстаивания в холодильнике в течение 2-3 суток. Осадок разбавляют в два раза дистиллированной водой. Суспензию хранят в холодильнике не более 14 суток. Водоросли вносят в культуру дафний из расчета 1 мл суспензии (600-1000 млн. кл/мл) на л воды.

1 - 2 раза в  неделю дафний кормят хлебопекарными  дрожжами. Для приготовления дрожжевого  корма 1 г свежих или 0,3 г воздушно-сухих дрожжей заливают 100 мл дистиллированной воды. После набухания дрожжи тщательно перемешивают. Образовавшуюся суспензию отстаивают в течение 30 мин. Недостающую жидкость добавляют в сосуды с дафниями в количестве 3 мл на 1 л воды.

Раствор дрожжей  хранится в холодильнике до двух суток. Можно кормить дафний сырым рисом. Рис предварительно размачивают  в теплой воде (3-4 ч.) и вносят в  культуру из расчета 1 - 2 зерна на 1 л  воды. Рис держат в культуре до 10 дней при постоянной продувке мелкодисперсными пузырьками воздуха. При хроническом опыте дафний кормят только хлореллой - по 5 капель на 100 мл.

При необходимости  биотестирования воды с общим  содержанием солей свыше 3 г/л  выращивают культуру, адаптированную к повышенной минерализации среды. Для этого в воду, в которой культивируют дафний и минерализация которой известна, постепенно порциями добавляют хлористый натрий. Вначале его вносят из расчета 500 мг/л. Через неделю минерализацию воды повышают еще на 250 мг/л. Эту операцию повторяют каждую неделю до тех пор, пока содержание солей в среде не достигнет нужного уровня (но не выше 6 г/л с учетом начальной минерализации). В дальнейшем достигнутый уровень минерализации среды поддерживают постоянно. Эта же среда служит контролем при биотестировании и в качестве разбавляющей. Адаптированных к повышенному содержанию солей дафний нельзя использовать для тестирования вод с более низким содержанием солей.

Чтобы получить исходный материал для биотестирования, 30-40 самок дафний с выводковыми  камерами полными яиц или зародышей, за 1 - 2 суток. До биотестирования пересаживают в 0,5 - 1 л емкости (стаканы, кристаллизаторы) с водой для культивирования, в которую перед посадкой дафний вносят корм. После появления молоди (каждая самка может выметать от 10 до 40 молодых дафний) взрослых особей удаляют.

При кратковременном  биотестировании используют только односуточных дафний, а двухсуточных самок - при длительном биотестировании.

Перед началом биотестирования  в пробе воды определяют концентрацию растворенного кислорода, которая должна быть не менее 6,0 мг/л (оптимально 6,0-7,0). Если она ниже 6,0 мг/л, то перед биотестированием воду аэрируют с помощью микрокомпрессора. В процессе биотестирования аэрировать воду не рекомендуется. Биотестирование проводят при тех же условиях, что и культивировании. Результаты биотестирования считают правильными, если гибель дафний в контроле не превышает 10% в остром опыте и 25% в хроническом и концентрация растворенного в тестируемой воде кислорода в конце биотестирования составляет не менее 2 мг/л.

Для определения наличия  острого токсического действия сточной  воды на сбросе в водный объект воду тестируют без разбавления. Если требуется сравнить степень токсичности  сточной воды, отобранной из разных мест или в разное время, готовят серию разбавлении (не менее трех).

Объем пробы воды для биотестирования  без разбавления - 500 мл, с учетом разбавлении - 1 л.

Посадку дафний в сосуды для биотестирования проводят следующим  способом: стеклянной трубкой диаметром 0,5 - 0,7 см отлавливают дафний из культуры, помещают в сачок из планктонного газа, погрузив его в тестируемую воду, переводят в нее дафний, посадку ведут от разбавлении тестируемой воды с большей кратностью к меньшей.

В сосуды наливают по 300 мл контрольной  и тестируемой воды или ее разбавлении. Повторность трехкратная. В каждый сосуд помещают по 10 односуточных дафний и экспонируют при оптимальных условиях в течение времени до 96 ч. При кратковременном биотестировании дафний не кормят.

Учет выживших дафний проводят через 1, 6, 24, 48, 72, 96 ч. Особей считают выжившими, если они свободно передвигаются в толще воды или  всплывают со дна сосуда не позднее 15 с после его легкого покачивания. Если в любой считываемый период времени в сточной воде гибнет 50 и более процентов дафний, биотестирование прекращают.

Для определения  наличия хронического токсического действия воды в контрольном и  других створах водного объекта  воду тестируют без разбавления. Если требуется сравнить степень  токсичности разных проб воды или использовать результаты биотестирования при установлении величин ПДС, готовят серию разбавлении. Определяют минимальную кратность разбавления, при которой хроническое токсическое действие не проявляется.