Автор работы: Пользователь скрыл имя, 04 Октября 2013 в 19:16, курсовая работа
Вірус Сендай належить до сімейства параміксовірусів, є патогенним для мишей, хом’яків, морських свинок і викликає в них легеневу пневмонію. В лабораторній практиці він широко застосовується як ініціатор гібридизації тваринних клітин.
Актуальність дослідження даного вірусу полягає в його структурній і функціональній подібності до інших представників сімейства параміксовірусів, які викликають захворювання у людей. А також в пошуку нових шляхів практичного застосування властивостей даного вірусу.
ВСТУП 4
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ 5
Історія відкриття вірусу Сендай 5
Морфологія вірусу сендай 7
Зовнішня будова 7
Ліпідна оболонка 9
Організація генома та вірусні білки 10
Нуклеокапсид 11
Вірусна РНК 12
Білок F 12
Білок NP 13
Білки M та NH 13
Білоки L та P 14
Реплікація вірусу Сендай 15
Приєднання вірусу до клітинної поверхні і його проникнення у клітину 15
Транскрипція і трансляція 16
Реплікація РНК 19
Генетичні взаємодії 20
Практичне використання вірусу Сендай в медицині та біотехнології 22
Історія виникнення методів гібридизації клітини 22
Механізм злиття клітин 24
Гібридизація соматичних клітин і картування
генів людини 28
Одержання α-лейкоцитарного інтерферону 31
Використання вірусу Сендай як вірусного вектора 33
Методи одержання та інактивації вірусу Сендай 34
Одержання
Метод 1 34
Метод 2 34
Титрування вірусу 36
Розрахунок титру 37
Інактивація 38
Інактивація ультрафіолетом 38
Інактивація β-пропілактоном 39
Інші методи інактивації 40
Метод злиття клітин нирок хом’яка з 41
еритроцитами курей
ВИСНОВКИ 42
ЛІТЕАТУРА 43
Можна було б думати, що РНК-полімерази
параміксовірусів роблять менше
помилок при зчитуванні, ніж відповідний
фермент вірусу грипу. Проте пряме
визначення рівня спонтанних мутацій
не виявило відмінностей між вірусами
грипу та Сендай [17]. Взагалі кажучи,
віруси з одноланцюговою РНК накопичують
мутації з більш високою
Основним класом умовно-летальних мутантів, що використовуються для вивчення функції параміксовірусних генів, є ts-мутанти [18]. Низький рівень рекомбінації не дозволяє побудувати карту параміксовірусів за допомогою генетичних методів. Однак інформація про взаємне розташування генів була отримана в серії експериментів по перериванню процесу транскрипції внаслідок УФ-пошкодження матриць [13], а також за допомогою методів молекулярного клонування і секвенування [16]. Описані, але не знайшли широкого застосування природні і безумовно-летальні мутації.
Для вірусу Сендай описані два класи ДІ-частинок, перший з яких типу «застібка». Не виявлено геномів вірусу Сендай, де делеція торкалася б тільки гена L, як це буває в РНК ДІ-частинок VSV типів LT і LT2 [19]. Однак виявлені інші делеціонні мутанти, що зберегли, як і частки класу LT, обидва кінці генома. Ці ДІ-РНК вірусу Сендай містять протяжні внутрішні делеції, що зачіпають більшість структурних генів і залишають інтактними тільки 3'-проксимальні фрагменти гена NP і 5'-проксімальний фрагмент гена L разом з відповідними кінцевими послідовностями. Такі ДІ-частинки отримали назву злитих, оскільки потенційно вони здатні кодувати злиті білки, що складаються з N-кінця NP і С-кінця L.
Отже геном вірусу представлений одноланцюговою «мінус-ланцюговою» РНК, з одним з найбільших серед РНК-вмісних вірусів геномом, що має 6 генів. Адсорбція вірусу на поверхні клітини відбувається в результаті взаємодії глікопротеїда HN зі специфічними рецепторами клітини. Репродукція відбувається в цитоплазмі. Нуклеокапсид підходить до тих ділянок мембрани, на яких з зовнішньої сторони вже вбудовані глюкопротеїди, а з внутрішньої М-білок.
4. ПРАКТИЧНЕ ВИКОРИСТАННЯ ВІРУСУ СЕНДАЙ В БІОТЕХНОЛОГІЇ ТА МЕДИЦИНІ
4.1. Історія виникнення методів гібридизації клітин
Припущення про те, що
соматичні клітини можуть зливатися
один з одним, було висловлено ще на
початку ХIX століття у зв'язку з
відкриттям багатоядерних клітин. В
історичному аспекті
Гібриди соматичних клітин були відкриті в 60-х роках ХХ століття. Вперше можливість гібридизації клітин, культивованих поза організмом, встановив в 1960 р. французький біолог Ж.Барскій [20]. Він зі співробітниками, вирощуючи поза організмом в культурі тканини клітини двох ліній мишей, виявив в невеликій кількості третій тип клітин. Ці клітини виявилися гібридними і могли розмножуватися in vitro. За морфологічними і біологічними ознаками гібридні клітини були проміжними між вихідними батьківськими клітинами. Вони відрізнялися за кількістю і морфологією хромосом, а також за здатністю до утворення пухлини при введенні їх мишам. Гібридні клітини містили число хромосом, відмінне від вихідних клітинних ліній, а також містили поверхневі антигени клітин обох батьківських ліній.
Однак, спонтанне злиття клітин у культурі тканини відбувається рідко, тому використання таких гібридних клітин для проведення біохімічних і генетичних експериментів ускладнене.
Було відомо, що клітини, заражені яким-небудь вірусом, можуть зливатися зі здоровими клітинами і утворювати гігантські багатоядерні клітини. Ці спостереження використовували І.Окада в Японії і Г.Харріс в Англії для розробки техніки гібридизації соматичних клітин.
Далі було встановлено, що клітинні гібриди можна отримати, використовуючи клітини різних видів тварин. В якості агента, що індукує злиття виступав інактивований вірус Сендай. З цього часу вірус Сендай став широко використовуватися в експериментах по злиттю клітин.
Вони використали для гібридизації парагриппозний вірус Сендай, що володіє здатністю зливати клітини між собою. В результаті обробки цього вірусу УФП або алкілуючим мутагеном вдається пошкодити його РНК і залишити неушкодженою білкову оболонку. Такий інактивований вірус втрачає свої інфекційні властивості, але зберігає здатність зливати соматичні клітини. За допомогою інактивованого вірусу Сендай вдалося підвищити вихід гібридних клітин в декілька тисяч разів.
Використовуючи вірус Сендай, вдалося здійснити злиття клітин абсолютно різних видів організмів і тканин. Наприклад, клітини людини можуть зливатися з клітинами миші, великої рогатої худоби, курки, комара. Такі міжвидові гібридні клітини виявляються життєздатними і часто розмножуються протягом тривалого часу. Факт сумісності клітин різного походження виявився вражаючим.
При вивченні міжвидових гібридних клітин, здатних до проліферації були зроблені два дуже важливих спостереження:
- В гібридах можуть проявитися обидва генома;
- В довгоживучих міжвидових
гібридах елімінуються
4.2. Механізм злиття клітин
Для індукції злиття клітин використовуються речовини різної природи. Іони Са2+, вірус Сендай, поліетиленгліколь, лізолецитин, моноолеат гліцерину.
Лізолецитин - поверхнево-активна
речовина ліпідної природи,
Моноолеат гліцерину
також з'єднання ліпідної
ПЕГ має властивість приховувати епітопи антигенів мембрани клітин від відповідних паратопів антитіл без істотного нанесення шкоди функції даного антигену, у зв'язку з чим його використовували в дослідах по отриманню групи крові О з А, В і АВ проте дослідження показують що оброблені таким чином еритроцити мають імуногенністю і , відповідно, низькою виживанням в організмі реципієнта при трансфузії [21].
Перевага вірусу Сендай як агента, що зливає клітини, полягає в повній відсутності цитотоксичного ефекту. Вірус перед вживанням інактививують, опромінюючи ультрафіолетовою лампою протягом 5 хвилин, при цьому він втрачає здатність до розмноження, але зберігає здатність зливати клітини. Вірус Сендай має два недоліки:
- Необхідність нарощувати,
титрувати, концентрувати і
- Клітини рослин і грибів не мають рецепторів до цього вірусу, тому він непридатний для їх гібридизації.
Рисунок 4.1 - Етапи злиття клітин:
А - 1-й етап, зближення цитоплазматичних мембран: 1 - глікопротеїди, 2 - ліпіди, 3 - плазматичні мембрани, 4 - мітохондрії, 5 - мікрофіламенти, 6 - частинки вірусу Сендай;
Б - 2-й етап, вихід
глікопротеїдів і оголення
В - 3-й етап, утворення міцел;
Г - початок 4-го етапу, злиття мембран, утворення цитоплазматичних містків [22].
Перший етап злиття (рис. 4.1) - зближення мембран сусідніх клітин і встановлення між ними тісного контакту. Мембрани повинні бути наближені один до одного на відстань у кілька ангстрем так, щоб між ними стали можливі взаємодії, подібні гідрофобним зв'язкам. Викликають подібне зближення агенти, індукують аглютинацію клітин. Вірус Сендай, поряд з іншими вірусами, які не обумовлюють злиття, перш за все викликає аглютинацію клітин, тобто досить тісне їх зближення, необхідне для успішного подальшого злиття.
Лектини і антитіла - дво- або полівалентні сполуки, і їх аглютинативна функція пов'язана зі здатністю однієї молекули якоїсь з цих сполук взаємодіяти з рецепторами, що знаходяться на поверхні двох клітин, що призводить до утворення зв'язку між клітинами. Достатня кількість таких молекулярних зв'язків може утримувати клітини разом, перешкоджаючи їх розходженню в результаті броунівського руху, в результаті електростатичного відштовхування, або в результаті активної міграції клітин.
На другому етапі
глікопротеїди, розташовані на
поверхні, починають вивільнятися
з ділянок мембрани, що лежать
між віріонами, і притягуються
до місць прикріплення
Вуглеводи перешкоджають
злиттю клітин, через те що
розділяють ліпідні шари
Третій етап - міцелізація
оголілих ліпідів двох
Четвертий етап - злиття
мембран. Завдяки місткам,
4.3. Гібридизація
соматичних клітин і
Для фізичного картування широко використовують методи гібридизації соматичних клітин. Зазвичай для гібридизації з клітинами людини застосовують соматичні клітини гризунів, найчастіше мишей. Для того щоб полегшити злиття клітин різних видів, в культуральне середовище додають вірус Сендай, інактивований ультрафіолетовим опроміненням.
Щоб відібрати клітин, які злилися, від вихідних клітин людини і миші клітини вирощують на спеціальному селективному середовищі, яке дозволяє розмножуватися тільки гібридним клітинам (для цього в дослідах по злиттю використовували лінії клітин мишей з недостатністю за деякими ферментам, найчастіше з недостатністю по тимідинкіназі). У гібридних клітинах, які щойно утворилися, ядра містять обидва набори хромосом: людини та миші. Однак подальше розмноження гібридних клітин призводить до поступової втрати хромосом людини у гібридів, тому в результаті залишається лише одна або навіть фрагмент однієї з хромосом людини. Коли метод гібридизації соматичних клітин був тільки створений, то тестувалося присутність в гібридних клітинах, в яких залишилася одна або кілька хромосом людини, ферментів та інших білків людини, які за своїми характеристиками відрізнялися від відповідних білків миші, або клітини миші були дефіцитні по деяким ферментам.