Вірус Сендай

Автор работы: Пользователь скрыл имя, 04 Октября 2013 в 19:16, курсовая работа

Описание работы

Вірус Сендай належить до сімейства параміксовірусів, є патогенним для мишей, хом’яків, морських свинок і викликає в них легеневу пневмонію. В лабораторній практиці він широко застосовується як ініціатор гібридизації тваринних клітин.
Актуальність дослідження даного вірусу полягає в його структурній і функціональній подібності до інших представників сімейства параміксовірусів, які викликають захворювання у людей. А також в пошуку нових шляхів практичного застосування властивостей даного вірусу.

Содержание работы

ВСТУП 4
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ 5
Історія відкриття вірусу Сендай 5
Морфологія вірусу сендай 7
Зовнішня будова 7
Ліпідна оболонка 9
Організація генома та вірусні білки 10
Нуклеокапсид 11
Вірусна РНК 12
Білок F 12
Білок NP 13
Білки M та NH 13
Білоки L та P 14
Реплікація вірусу Сендай 15
Приєднання вірусу до клітинної поверхні і його проникнення у клітину 15
Транскрипція і трансляція 16
Реплікація РНК 19
Генетичні взаємодії 20
Практичне використання вірусу Сендай в медицині та біотехнології 22
Історія виникнення методів гібридизації клітини 22
Механізм злиття клітин 24
Гібридизація соматичних клітин і картування
генів людини 28
Одержання α-лейкоцитарного інтерферону 31
Використання вірусу Сендай як вірусного вектора 33
Методи одержання та інактивації вірусу Сендай 34
Одержання
Метод 1 34
Метод 2 34
Титрування вірусу 36
Розрахунок титру 37
Інактивація 38
Інактивація ультрафіолетом 38
Інактивація β-пропілактоном 39
Інші методи інактивації 40
Метод злиття клітин нирок хом’яка з 41
еритроцитами курей
ВИСНОВКИ 42
ЛІТЕАТУРА 43

Файлы: 1 файл

Вірус Сендай.docx

— 991.03 Кб (Скачать файл)

Можна було б думати, що РНК-полімерази параміксовірусів роблять менше  помилок при зчитуванні, ніж відповідний  фермент вірусу грипу. Проте пряме  визначення рівня спонтанних мутацій  не виявило відмінностей між вірусами грипу та Сендай [17]. Взагалі кажучи, віруси з одноланцюговою РНК накопичують  мутації з більш високою частотою, ніж віруси з дволанцюговим геномом, в першу чергу тому, що у них  відсутній механізм корекції за другим ланцюгом [14]. З цього випливає, що мутанти по білка НN і Р з'являються з тією ж частотою, що і мутанти по білках НА і NА, але мають понижену життєздатністю. Пояснюється це, можливо, тим, що більшість амінокислот в параміксовірусних глікопротеїнах відіграє структурну або функціональну роль і не можуть бути заміщені без втрати життєздатності вірусу.

Основним класом умовно-летальних  мутантів, що використовуються для  вивчення функції параміксовірусних  генів, є ts-мутанти [18]. Низький рівень рекомбінації не дозволяє побудувати карту параміксовірусів за допомогою генетичних методів. Однак інформація про взаємне розташування генів була отримана в серії експериментів по перериванню процесу транскрипції внаслідок УФ-пошкодження матриць [13], а також за допомогою методів молекулярного клонування і секвенування [16]. Описані, але не знайшли широкого застосування природні і безумовно-летальні мутації.

Для вірусу Сендай описані  два класи ДІ-частинок, перший з  яких типу «застібка». Не виявлено геномів  вірусу Сендай, де делеція торкалася  б тільки гена L, як це буває в РНК  ДІ-частинок VSV типів LT і LT2 [19]. Однак виявлені інші делеціонні мутанти, що зберегли, як і частки класу LT, обидва кінці генома. Ці ДІ-РНК вірусу Сендай містять протяжні внутрішні делеції, що зачіпають більшість структурних генів і залишають інтактними тільки 3'-проксимальні фрагменти гена NP і 5'-проксімальний фрагмент гена L разом з відповідними кінцевими послідовностями. Такі ДІ-частинки отримали назву злитих, оскільки потенційно вони здатні кодувати злиті білки, що складаються з N-кінця NP і С-кінця L.

Отже геном вірусу представлений  одноланцюговою «мінус-ланцюговою»  РНК, з одним з найбільших серед  РНК-вмісних вірусів геномом, що має 6 генів. Адсорбція вірусу на поверхні клітини відбувається в результаті взаємодії глікопротеїда HN зі специфічними рецепторами клітини. Репродукція відбувається в цитоплазмі. Нуклеокапсид підходить до тих ділянок мембрани, на яких з зовнішньої сторони вже вбудовані глюкопротеїди, а з внутрішньої М-білок.

 

4. ПРАКТИЧНЕ ВИКОРИСТАННЯ  ВІРУСУ СЕНДАЙ В БІОТЕХНОЛОГІЇ  ТА МЕДИЦИНІ

 

4.1. Історія виникнення  методів гібридизації клітин

 

 

Припущення про те, що соматичні клітини можуть зливатися  один з одним, було висловлено ще на початку ХIX століття у зв'язку з  відкриттям багатоядерних клітин. В  історичному аспекті представляє  інтерес та обставина, що відкриття  полікаріонів як би підтверджувало помилкове уявлення Шлейдена, який вважав, що нові клітини зароджуються у вигляді бульбашок усередині цитоплазматичної мембрани батьківських клітин. Поділяв цю точку зору Рудольф Вірхов представивши у 1851 р. малюнок багатоядерної пухлинної клітини з повною впевненістю в тому, що ядра є ендогенними зачатками нових клітин. Крім того, відкриття полікаріонів підлило масла у вогонь боротьби з клітинною теорією. Противники її висунули гіпотезу, згідно якої організм являє собою єдину тканинну масу з безперервною цитоплазмою, а існування полікаріонів розглядали як підтвердження цієї гіпотези.

Гібриди соматичних клітин були відкриті в 60-х роках ХХ  століття. Вперше можливість гібридизації клітин, культивованих поза організмом, встановив  в 1960 р. французький біолог Ж.Барскій [20]. Він зі співробітниками, вирощуючи поза організмом в культурі тканини клітини двох ліній мишей, виявив в невеликій кількості третій тип клітин. Ці клітини виявилися гібридними і могли розмножуватися in vitro. За морфологічними і біологічними ознаками гібридні клітини були проміжними між вихідними батьківськими клітинами. Вони відрізнялися за кількістю і морфологією хромосом, а також за здатністю до утворення пухлини при введенні їх мишам. Гібридні клітини містили число хромосом, відмінне від вихідних клітинних ліній, а також містили поверхневі антигени клітин обох батьківських ліній.

Однак, спонтанне злиття клітин у культурі тканини відбувається рідко, тому використання таких гібридних  клітин для проведення біохімічних  і генетичних експериментів ускладнене.

Було відомо, що клітини, заражені яким-небудь вірусом, можуть зливатися зі здоровими клітинами  і утворювати гігантські багатоядерні клітини. Ці спостереження використовували  І.Окада в Японії і Г.Харріс в  Англії для розробки техніки гібридизації соматичних клітин.

Далі було встановлено, що клітинні гібриди можна отримати, використовуючи клітини різних видів  тварин. В якості агента, що індукує  злиття виступав інактивований вірус  Сендай. З цього часу вірус Сендай став широко використовуватися в  експериментах по злиттю клітин.

Вони використали для  гібридизації парагриппозний вірус Сендай, що володіє здатністю зливати клітини між собою. В результаті обробки цього вірусу УФП або алкілуючим мутагеном вдається пошкодити його РНК і залишити неушкодженою білкову оболонку. Такий інактивований вірус втрачає свої інфекційні властивості, але зберігає здатність зливати соматичні клітини. За допомогою інактивованого вірусу Сендай вдалося підвищити вихід гібридних клітин в декілька тисяч разів.

Використовуючи вірус  Сендай, вдалося здійснити злиття клітин абсолютно різних видів організмів і тканин. Наприклад, клітини людини можуть зливатися з клітинами миші, великої рогатої худоби, курки, комара. Такі міжвидові гібридні клітини виявляються життєздатними і часто розмножуються протягом тривалого часу. Факт сумісності клітин різного походження виявився вражаючим.

При вивченні міжвидових гібридних  клітин, здатних до проліферації були зроблені два дуже важливих спостереження:

- В гібридах можуть  проявитися обидва генома;

- В довгоживучих міжвидових  гібридах елімінуються хромосоми  одного виду.

 

 

4.2. Механізм злиття  клітин

 

 

Для індукції злиття клітин використовуються речовини різної природи. Іони Са2+, вірус Сендай, поліетиленгліколь, лізолецитин, моноолеат гліцерину.

 Лізолецитин - поверхнево-активна  речовина ліпідної природи, продукт  деградації лецитину шляхом обробки  останнього фосфоліпазою А. Лізолецітін  пошкоджує мембрану і токсичний  для живих систем.

 Моноолеат гліцерину  також з'єднання ліпідної природи,  але його шкідливу дію менш  виражено, а частота злиття клітин  при застосуванні цієї речовини  зростає в 4-7 разів порівняно  із спонтанним процесом.

ПЕГ має властивість приховувати  епітопи антигенів мембрани клітин від відповідних паратопів антитіл без істотного нанесення шкоди функції даного антигену, у зв'язку з чим його використовували в дослідах по отриманню групи крові О з А, В і АВ проте дослідження показують що оброблені таким чином еритроцити мають імуногенністю і , відповідно, низькою виживанням в організмі реципієнта при трансфузії [21].

 Перевага вірусу Сендай  як агента, що зливає клітини,  полягає в повній відсутності  цитотоксичного ефекту. Вірус перед  вживанням інактививують, опромінюючи ультрафіолетовою лампою протягом 5 хвилин, при цьому він втрачає здатність до розмноження, але зберігає здатність зливати клітини. Вірус Сендай має два недоліки:

- Необхідність нарощувати, титрувати, концентрувати і інактивувати  вірус;

- Клітини рослин і  грибів не мають рецепторів  до цього вірусу, тому він непридатний  для їх гібридизації.

Рисунок 4.1 - Етапи злиття клітин:

  А - 1-й етап, зближення  цитоплазматичних мембран: 1 - глікопротеїди, 2 - ліпіди, 3 - плазматичні мембрани, 4 - мітохондрії, 5 - мікрофіламенти, 6 - частинки  вірусу Сендай;

  Б - 2-й етап, вихід  глікопротеїдів і оголення ліпідних  шарів мембрани;

  В - 3-й етап, утворення міцел;

  Г - початок 4-го  етапу, злиття мембран, утворення цитоплазматичних містків [22].

 

 Перший етап злиття (рис. 4.1) - зближення мембран сусідніх клітин і встановлення між ними тісного контакту. Мембрани повинні бути наближені один до одного на відстань у кілька ангстрем так, щоб між ними стали можливі взаємодії, подібні гідрофобним зв'язкам. Викликають подібне зближення агенти, індукують аглютинацію клітин. Вірус Сендай, поряд з іншими вірусами, які не обумовлюють злиття, перш за все викликає аглютинацію клітин, тобто досить тісне їх зближення, необхідне для успішного подальшого злиття.

Лектини і антитіла - дво- або полівалентні сполуки, і їх аглютинативна функція пов'язана зі здатністю однієї молекули якоїсь з цих сполук взаємодіяти з рецепторами, що знаходяться на поверхні двох клітин, що призводить до утворення зв'язку між клітинами. Достатня кількість таких молекулярних зв'язків може утримувати клітини разом, перешкоджаючи їх розходженню в результаті броунівського руху, в результаті електростатичного відштовхування, або в результаті активної міграції клітин.

 На другому етапі  глікопротеїди, розташовані на  поверхні, починають вивільнятися  з ділянок мембрани, що лежать  між віріонами, і притягуються  до місць прикріплення вірусних  частинок [22]. Вуглеводні компоненти - найменш вивчена частина клітинної поверхні. У мембранах вони зустрічаються у вигляді нейтральних цукрів, а також ковалентно зв'язуються з ліпідами або білками. Саме в такому вигляді вони активно беруть участь у багатьох біологічних процесах. Встановлено, що глікопротеїди визначають антигенну специфічність клітин, несуть негативний заряд, характерний для клітин при фізіологічно нейтральних рН, беруть участь в розпізнаванні та адгезії клітин, визначають рецепторні ділянки для вірусів, бактерій, аглютинативна агентів, беруть участь в процесі регуляції проникності мембран для іонів. Ці властивості і визначають їх участь у злитті клітин.

 Вуглеводи перешкоджають  злиттю клітин, через те що  розділяють ліпідні шари мембран,  не даючи їм стикатися, а   на поверхні нормальної клітини  рецепторні ділянки розташовані  рідко або поодинці. В результаті  трансформації вірусом відбувається  їх об'єднання в групи. Глікопротеїди  мігрують в мембрані до місця  адсорбції вірусу, залишаючи вільними  сусідні ділянки, де і відбувається  злиття клітин. В деяких випадках  у видаленні вуглеводних груп, що перешкоджають злиттю клітин, беруть участь лізосомні ферменти. При цьому відбувається з'єднання  лізосом або бульбашок АГ з  плазматичною мембраною, і локальне  вивільнення глікозидаз. Така лізосомна  активність може бути запрограмована (в гаметах, міобластах, макрофагах, тобто клітинах, що зливаються  в природних умовах) або викликана  експериментально при індукованому  злиття клітин.

 Третій етап - міцелізація  оголілих ліпідів двох протилежних  мембран. Міцели - ліпідні краплі, де молекули ліпідів гідрофільними  головками звернені до води, а  гідрофобні "хвости" жирних кислот  заховані всередину. Цей процес  посилюється при високих значеннях  рН і високій концентрації  іонів кальцію. В обох клітинах  починається ендоцитоз вірусних  частинок.

 Четвертий етап - злиття  мембран. Завдяки місткам, утвореним  Са2+, розмір міцел зменшується. Під дією АТФ та Са2+, активізуються мікрофіламенти [23]. Цитоплазматичний місток,що при цьому виникає, стабілізується і розширюється завдяки функціонуванню мікрофіламентів. На останніх етапах злиття клітин важливу роль відіграє наявність АТФ. АТФ утворюється завдяки діяльності мітохондрій. Полікаріони, що утворюються при злитті двох або трьох клітин, є не безформні роздуті або дволопатеве кулі цитоплазми, а приймають форму, характерну для однієї з батьківських клітин або проміжну між ними. Форму клітини визначають мікротрубочки і мікрофіламенти. В процесі злиття клітин мікрофіламенти актиноміозиновго типу, розташовані під цитоплазматичної мембраною, беруть безпосередню участь, тому що забезпечують об'єднання цитоплазм клітин, що злилися, і стабілізацію новоствореної системи. Однак, формування цитоскелету - енергозалежний процес, що вимагає великої кількості АТФ. Мабуть, цим обумовлено присутність мітохондрій в місцях злиття клітинних мембран [22].

 

 

 

 

4.3. Гібридизація  соматичних клітин і картування  генів людини

 

 

Для фізичного картування широко використовують методи гібридизації соматичних клітин. Зазвичай для гібридизації з клітинами людини застосовують соматичні клітини гризунів, найчастіше мишей. Для того щоб полегшити злиття клітин різних видів, в культуральне середовище додають вірус Сендай, інактивований ультрафіолетовим опроміненням.

Щоб відібрати клітин, які злилися, від вихідних клітин людини і миші клітини вирощують на спеціальному селективному середовищі, яке дозволяє розмножуватися тільки гібридним клітинам (для цього в дослідах по злиттю використовували лінії клітин мишей з недостатністю за деякими ферментам, найчастіше з недостатністю по тимідинкіназі). У гібридних клітинах, які щойно утворилися, ядра містять обидва набори хромосом: людини та миші. Однак подальше розмноження гібридних клітин призводить до поступової втрати хромосом людини у гібридів, тому в результаті залишається лише одна або навіть фрагмент однієї з хромосом людини. Коли метод гібридизації соматичних клітин був тільки створений, то тестувалося присутність в гібридних клітинах, в яких залишилася одна або кілька хромосом людини, ферментів та інших білків людини, які за своїми характеристиками відрізнялися від відповідних білків миші, або клітини миші були дефіцитні по деяким ферментам.

Информация о работе Вірус Сендай