Вірус Сендай

Так, наприклад, якщо при  титруванні з початкового розведення 1:11 реакція (+) реєструється в 6-й пробірці, то в нашій системі міститиметься 11·32 (2⁵ = 32) аглютинативних доз. Так як реакція відбувається в об’ємі 0,25 мл, ми маємо цю величину помножити на 4. Але, оскільки кінцева концентр ція еритроцитів у системі дорівнює 0,5%, а не 1%, отриману величину потрібно розділити на 2. В результаті отримуємо титр 704 ГАО/мл, або 2,847 логарифмічних одиниць. Те ж саме виходить більш простим способом при додаванні логарифма початкового розведення з логарифмом кінцевої точки титрування (тобто примноження 0,3 на число пробірок: 0,3·6 = 1,8); отримуємо 1,04 + 1,8 = 2,84. (Різниця в третьому знаку після коми виникає в результаті округлення логарифмів як початкового розведення, 1,0414 до 1,04, так і множника 0,30103 до 0,3= log2). Підрахунок з використанням логарифмів придатний і для дрібних титрів. Так, при початковому розведенні 1:500 з повною аглютинацією в другій пробірці (++) і при її відсутності в третій (--), кінцева точка титрування припадає на 2,5 пробірки; звідси логарифм титру буде дорівнює 2,7 + (0,3·2,5) = 3,45, а сам титр -2818 ГАО/мл.

В середньому вихід вірусу Сендай в аллантоїсній рідині складає  близько 1800 ГАО/мл, або 3,25 ± 0,20 логарифмічних  одиниць.

5.2.Інактивація

 

5.2.1. Інактивація  ультрафіолетом

 

 

Ефективність УФ-променів визначається їх проникністю і адсорбцією біологічними молекулами. Білки поглинають УФ-промені в меншому ступені, ніж нуклеїнові кислоти, і тому більш  стійкі до їх дії [31].

Ультрафіолетове опромінення  викликає зміни структури нуклеїнових  кислот, які полягають в утворенні  димерів між сусідніми піримідиновими основами, а також ковалентних  зв'язків між нуклеїновою кислотою і білковою оболонкою. Пошкодження  ДНК приводять до інактивації  вірусу Сендай.

Викликаючи глибокі зміни  в структурі нуклеїнових кислот вірусів, УФ-промені не чинять істотного  впливу на білкову оболонку, внаслідок  чого інактивовані віруси здатні зберігати  свою антигенну і імуногенну активність.

Однак такі особливості УФ-випромінювання як складність вибору і контролю оптимальної  дози, що забезпечує інактивацію вірусу зі збереженням антигенних властивостей, а також ефекти екранування і  фотореактивації ускладнюють практичне  отримання безпечних інактивованих  препаратів.

Інактивація ультрафіолетом(методика)

Помістити 1 мл концентрованої суспензії вірусів в часове скло і витримати 3 хв під УФ-світлом  від герміцидної лампи 15 Вт (потужність дози опромінення 3000 ерг /см ²/ сек). Перемішувати суспензію через 1 та 2 хвилини опромінення.

 

 

 

5.2.2.Інактивація  β-пропілактоном

 

 

β-пропіолактоном являє собою  високоактивний алкілуючий агент, нестійкий  у водних розчинах і легко гідролізується з утворенням нешкідливих речовин: гідроакрилової і бета-оксіпропіонової  кислот. У зв'язку з цим відпадає необхідність в нейтралізації надлишку бета-пропіолактону і продуктів  його розпаду [32].

β-пропіолактоном чинить інактивуючу  дію на багато вірусів. Бета-пропіолактоном руйнує інфекційність вірусу Сендай, не впливаючи на його антигенні властивості. Висловлено припущення, що втрата інфекційності  вірусами Сендай і ньюкаслської хвороби  обумовлена ​​взаємодією бета-пропіолактоном з вірусним геномом.

І нактивація вірусів бета-пропіолактоном залежить від концентрації інактиватора, температури взаємодії та вмісту білка в вірусної суспензії. Підвищення концентрації бета-пропіолактону може привести до небажаної реакції з  вірусними білками і, внаслідок  цього, до зниження антигенної активності.

Інактивація β-пропілактоном(методика)

• Приготувати 10%-ний водний розчин β-пропіолактону(рис 5.1) без посередньо перед використанням.
• Розбавити до 1,3% ізотонічним сольовим розчином, що містить 1,68% NаНСОз.
• Додати 1 частина розведеного розчину β-пропіолактону до 9 частин суспензії вірусу Сендай (титр гемагглютації між 1:200 і 1:10000).

Рисунок 5.1 Структурна формула β-пропілактоноу [32]

Струшувати в ретельно закупореному контейнері при 4°С протягом 10 хв і потім витримати при 37°  С на протязі 2-х годин, струшуючи  кожні 10 хв.

• Зберігати протягом ночі при 4 ° С для забезпечення повного, гідролізу р-пропіолактону.
• Інактивований вірус можна зберігати за присутністі 0,5%-ного сироваткового альбуміну при -65 °С протягом 5 тижнів.

 

 

5.2.3.Інші методи  інактивації

 

 

До простих і доступних  методам інактивації вірусів  відносять фотодинамічнй вплив  деяких барвників, таких як метиленовая  синька, акридиновий оранжевий, толуідін синій, нейтральний червоний та інші, до яких чутливі багато вірусів. Найбільш ймоірний механізм такої інактивації - зміна або відщеплення гуаніну  без розриву полінуклеотидного  ланцюга геномів. Обробка вірусу Сендай родаміном-В, діамантовим зеленим  і фіолетовим Гофмана супроводжувалася частковою модифікацією РНК без  зміни капсидних білків. Інактивований  препарат має високу імуногенність.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5.3. Методика злиття  клітин нирок хом’яка 

з еритроцитами курей

 

 

Еритроцити птахів мають  ядра, але вірус Сендай, крім того, що він індукує аглютинацію, викликає також гемоліз, так що в злитті беруть участь тіні еритроцитів, що мають  ядра і при цьому містять мало цитоплазми.

Спершу трипсінізують клітини хом'ячка і ресуспендіюють їх в середовищі Ігла з 10% сироваткою теляти. Промивають двічі центрифугуванням і ресуспендують у свіжій НСІ без сироватки до концентрації 2-10⁶ клітин в 1 мл.

Далі виділяють еритроцити з 17-денного заплідненого курячого яйця. Для цього видаляють шкаралупу над повітряним мішком, розрізають кровоносні судини в оболонці і дають крові вилитися в аллантоїсну рідину. Видаляють рідину і промивають клітини НСІ без сироватки (0,5 мл).

Наступним кроком є змішування 0,1 мл суспензії клітин хом'ячка з 0,1 мл суспензії еритроцитів і 0,1 мл інактивованого вірусу Сендай (200 ГАО) в 15-мілілітровій стерильній центрифужній пробірці і інкубувати при 37°С протягом 25 хв.

Доливають в пробірку НСІ з 10% сироваткою теляти до загального обсягу 5 мл і переносять суспензію в чашку Петрі діаметром 5 см, що містить покривні скельця. Інкубують при 37°С в термостаті, що продувається СО₂.

Видаляють покривні скеельця, промивають їх двічі в ФСБ-А і фіксують в метанолі (10 хв). Забарвлюють 3 хв по Мей-Грюнвальд Гімза, промивають дистильованою водою і ацетоном та закріплюють на предметному скельці клітинами всередину.

 

 

ВИСНОВКИ

 

 

1. Морфологічно вірус Сендай являє собою сферичний вірус зі спірально-симетричним нуклеокапсидом, утвореним нуклеокапсидним NP білком, і оточеним ліпопротеїдною оболонкою, вкритою довгими глікопротеїдними шипикаим, бобудованими з білків  F та NH.
2. Генетично вірусу представлений «мінус-ланцюговою» РНК, з одним з найбільших серед РНК-вмісних вірусів геномів, що має 6 генів. Адсорбція вірусу на поверхні клітини відбувається в результаті взаємодії глікопротеїда HN зі специфічними рецепторами клітини. Репродукція відбувається в цитоплазмі. Нуклеокапсид підходить до тих ділянок мембрани, на яких з зовнішньої сторони вже вбудовані глюкопротеїди, а з внутрішньої М-білок.
3. Вірусу Сендай як агента, що ініціює злиття клітин позбавлений недоліків пов’язаних зі штучними ініціаторами полі етиленгліколем, лізолетицином та ін.
4. Вірус Сендай відіграє важливу роль у розшифровці генетичного коду хромосом людини.
5. Вірус Сендай має важливе значення як сучасний засіб виготовлення препаратів інтерферонів.
6. В найсучасніших дослідженнях вірус Сендай використовується як генетичний вектор, що відкриває абсолютно нові можливості його застосування.
7. Розглянуто основні методи та прийоми роботи з вірусом Сендай, методи його інактивації.

 

 

 

ЛІТЕРАТУРА

 

 

1. Горбунова А.С. Вирус Сендай – возбудитель гриппоподобных заболеваний человека и животных – М.: Академия медицинских наук, 1964. – 194 с.
2. Am J. Pathol Sendai virus infection in genetically resistant and susceptible mice // The American journal of patology. – 1987. – 61(5). – P. 1670–1671
3. Букринская А.Г., Зайдес В.М. Молекулярная биология парамиксовирусов – М.: Медицина, 1978. – 182 с.
4. Филдс Б., Найп Д. Вирусология. В 3 т. – М.: Мир, 1989.–Т.2–496 с.
5. Shibata H, Masuda S, Ikeda T, Hasegawa M, Hanazono Y. Knockout Sendai virus infections, 1985 – 24 с.
6. Феннер Ф. Биология вирусов животных. В 2 т. – М.: Мир, 1977. – Т.1– 625 с.
7. Жданов В.М. Внутриклеточная транскрипция генома парамиксовирусов в составе нуклеокапсида // Докл. АН СССР, 1972–Т.2–162 с.
8. Baker C., Moyer A. Encapsidation of Sendai virus genome RNAs by purified NP protein during in vitro replication // Journal Virology. – 1988. –62(3) . – P. 834–838.
9. Sanderson C., Wu H., Nayak D. Sendai virus M protein binds independently to either the F or the HN glycoprotein in vivo // Journal Virology. – 1994. – 68(1) . – P. 69–76.
10. Ali A, Nayak D. M protein interacts with F and HN proteins and with the cytoplasmic tail and transmembrane domain of F protein // Journal Virology. – 2000 . –276(2) . – P. 289-303.
11. Andrea M., Moerdyk-Schauwecker M. Sequence-Function Analysis of the Sendai virus L protein domains // Journal Virology. – 2010. – 405(2) . – P. 370–382.
12. Curran J. A Role for the Sendai Virus P Protein Trimer in RNA Synthesis // Journal of virology, – 1998. –72(5) . – P. 4274–4280.
13. Takemasa Sakaguchi, Shin-ichi Takao Expression of the HN, F, NP and M proteins of Sendai virus by recombinant vaccinia viruses and their contribution to protective immunity against Sendai virus infections in mice // Journal of General Virology, – 1993. – 74(3) . – P. 479–484.
14. Пейлиз П., Кингсбери Д. У. Генетика вирусов гриппа – М.: Медицина, 1986. – 332 с.
15. Гинтер Е.К. Медицинская генетика  – М.: Медицина, 2003. – 449 с.
16. Оловникова Н. И. Иммуногематология в трансфузиологии в начале ХXI века // Гематология и трансфузиология, 2001.– Т. 46.– № 3.– с. 95–100.
17. Михальчук В.Н., Дивоча В.А., Гоженко А.И Биохимико-вирусологическое обоснование антипротеазной терапии гриппа // Актуальные проблемы транспортной медицины. – 2008. №2(12). – с. 118-124.
18. Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика: в 3-х т. — М.: Мир, 1987. — Т. 1. — 295 c.
19. Rossio J.L., Esser M.T., Suryanarayana K. et al. // J. Virology. –1998. –V.72, N10. –P. 7992–8001.
20. Катмаков П.С., Бушов А.В. Биотехнология в животноводстве – Ульяновск.: Ульяновская ГСХА, 2008. – 154 с.
21. Garratty G. Modulating the red cell membrane to produce universal/stealth donor red cells suitable for transfusion // Vox Sang, – 2008. – 94(2) . – P. 87-95.
22. Nancy R.  Cell chimera// African Violet Magazine, – 2003. –56(4) . – P. 15-23.
23. Иван Л. Камерон, Томас Б. Пул Трансформированная клетка. – К.: Наукова думка, 1985. – 380 с.
24. Михальський Л. О. Деякі сучасні напрями біотехнології у лекційному курсі для магістрів біології – К:. КМ Академія, 2004. -103 с.
25. Волкова П., Галаутдинова Н., Пархоменко Т., Казьянин А. Опыт использования вируса Сендай в условиях крупномасштабного производства интерферона // Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов: Тез. докл., Томск.—2001.—с. 22-23.
26. Дивоча В. А., Михальчук В. Н., Гоженко А. И. молекулярно-биологическое обоснование антипротеиназной терапии гриппа “Журн. АМН України”, 2009, т. 15, № 1. — с. 19–31.
27. Palese P. RNA virus vectors: where are we and where do we need to go? // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1998. - Vol. 95, № 22. - P. 12750-12752.
28. Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков – М.: Мир, 1983. – 262 с.
29. Лефковитса И., Перниса Б. Методы исследований в иммунологии – М.: Мир, 1981. – 486 с.
30. Манк М. Биология развития млекопитающих. Методы. – М.: Мир, 1990. – 407 с.
31. Смит К., Хэнеуолт Ф. Молекулярная фотобиология – М.:Мир, 1972. – 320 с.
32. Грешман Т., Шавер Ф. Общая органическая химия – М.:Мир, 1983. – 394 с.