Изучение мембранотропности стрептомицина

В-третьих, изменения  под влиянием ксенобиотиков барьерно-транспортных свойств мембраны. Мембранотропность такого рода может быть прямой и опосредованной.

В-четвертых, функциональное взаимодействие с веществами, действие которых на уровне мембран можно считать установленным. Экспериментально выявляется стимуляция или угнетение под влиянием ксенобиотиков ряда гормональных веществ, природных соединений, а также аналогичное обратное действие указанных веществ. Интерпретация этих взаимоотношений сложна.

При рассмотрении всякого  экзогенного влияния ксенобиотика на биологический объект предполагается, что молекулы эффектора сначала связываются с некими центрами сродства на мембране, инициируя тем самым определенную реакцию клетки (организма). Соответственно такой процесс и его анализ делятся на три части:

а) установление характера  и локализация центров связывания;

б) оценка сродства к ним  эффектора;

в) исследование развития реакции объекта на образование комплексов центров связывания с молекулами эффектора[3].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2 Аминогликозиды

 

2.1 Строение

 

Группа антибиотиков, общим в химическом строении которых является наличие в молекуле аминосахара, соединённого гликозидной связью с аминоциклическим кольцом. Основное клиническое значение аминогликозидов заключается в их активности в отношении аэробных грамотрицательных бактерий.

Аминогликозиды являются одним из ранних классов антибиотиков. Первый аминогликозид - стрептомицин был получен в 1944г. Впервые антибиотик этой группы (стрептомицин) был выделен из лучистого гриба Actinomyces globisporus streptomycini в середине прошлого столетия. Позже были выделены (из лучистого гриба Actinomyces) канамицин и гентамицин (Micromonospora). Кроме того, был получен полусинтетическим путем амикацин. Группа аминогликозидных антибиотиков охватывает свыше 100 природных соединений.

Характерной особенностью антибиотиков этой группы является присутствие  в их молекулах общих структурных  элементов: аминосахаров, соединенных  гликозидной связью с агликоновым фрагментом[9].

 

2.2 Химическое название

 

O-2-Дезокси-2-(метиламино) - альфа-L-глюкопиранозил (1 - 2) - О- 5 - дезокси- 3 - С - формил - альфа- L-ликсофуранозил (1-4)-N, N'-бис (аминоиминометил) - D-стрептамин (в виде сульфата) [12].

 

Брутто-формула

C₂₁H₃₉N₇O₁₂

 

 

 

 

2.3 Исторические сведения

Исторически первым аминогликозидом  был стрептомицин, выделенный в 1944 году Ваксманом с сотр. (США)   из актиномицета Streptomyces griseus. Он также был одним из первых известных антибиотиков вообще, вторым после пенициллина. В 1957 году был выделен канамицин. Продуцентом стрептомицина по Ваксману является актиномицет (лучистый гриб) — Streptomyces griseus. Советские исследователи (Н. А. Красильников, 1949) относят культуру актиномицета, образующего стрептомицин, к Act. globisporus streptomycini. Позднее было предложено называть организм, образующий стрептомицин, Act. streptomycini. Впоследствии были обнаружены другие актиномицеты, образующие близкие к стрептомицину антибиотики, — оксистрептомицин и др[18].

Стрептомицин — это  общее (групповое) название нескольких соединений, близких по своему химическому  строению. В состав стрептомицинового  комплекса входят следующие природные  соединения: стрептомицин, маннозидострептомицин, оксистрептомицин, а также соединения, полученные восстановлением двух первых — дигидрострептомицин и дигидроманнозидострептомицин.

На заре эры антибиотикотерапии стрептомицин, наряду с пенициллином, применяли широко и практически  бесконтрольно, в том числе и  при банальных инфекциях, которые в настоящее время не расцениваются как показания к назначению аминогликозидных антибиотиков. Это способствовало нарастанию устойчивости возбудителей банальных инфекций к стрептомицину и появлению частичной перекрёстной устойчивости к другим аминогликозидам. Впоследствии стрептомицин из-за высокой ототоксичности и нефротоксичности, а также из-за быстрого развития устойчивости большинства часто встречающихся возбудителей к нему стали применять почти исключительно в составе комбинированных режимов специфической химиотерапии туберкулёза, а также некоторых редких, почти ликвидированных в настоящее время инфекций, таких, как чума, а основным применяемым аминогликозидом в остальных клинических ситуациях на долгое время стал канамицин. В настоящее время основными, наиболее часто применяемыми, аминогликозидными антибиотиками являются препараты II поколения, в частности, гентамицин. Частота назначения канамицина значительно снизилась в связи с тем, что он обладает более высокой ото - и нефротоксичностью по сравнению с препаратами II поколения, а также в связи с нарастанием устойчивости возбудителей к канамицину. Аминогликозид III поколения амикацин рассматривается в настоящее время как препарат резерва, который нежелательно назначать широко и часто, чтобы предотвратить распространение устойчивости возбудителей к нему. Устойчивость возбудителей к амикацину пока распространена мало. Перекрёстная устойчивость с другими аминогликозидами неполная, и часто возбудители, устойчивые к аминогликозидам II поколения, остаются чувствительными к амикацину. Характерно также, что устойчивость возбудителей к амикацину нарастает медленнее, чем к препаратам II поколения. Устойчивость возбудителей к препаратам II поколения, в частности гентамицину, также развивается медленнее, чем к препаратам I поколения канамицину и стрептомицину.

Стрептомицин является вторым после пенициллина антибиотиком, который сыграл очень важную роль в лечении инфекционных заболеваний, особенно туберкулеза[13].

 

2.4 Классификация аминогликозидов

 

В настоящее время  выделяют три поколения аминогликозидов.

 

Таблица 2.1

Классификация аминогликозидов

 

I поколение	II поколение	III поколение
Стрептомицин	Гентамицин	Амикацин
Неомицин	Тобрамицин
Канамицин	Нетилмицин

 

 

Основное клиническое  значение аминогликозиды имеют при  лечении нозокомиальных инфекций, вызванных аэробными грамотрицательными возбудителями, а также инфекционного эндокардита. Стрептомицин и канамицин используют при лечении туберкулеза. Неомицин как наиболее токсичный среди аминогликозидов применяется только внутрь и местно. Аминогликозиды обладают потенциальной нефротоксичностью, ототоксичностью и могут вызывать нервно-мышечную блокаду. Однако учет факторов риска, однократное введение всей суточной дозы, короткие курсы терапии и ТЛМ могут уменьшить степень проявления НР[4].

3 Общие свойства

3.1 Физико-химические свойства стрептомицина

Аминогликозиды являются бактерицидными антибиотиками, то есть непосредственно убивают чувствительные к ним микроорганизмы (в отличие от бактериостатических антибиотиков, которые лишь тормозят размножение микроорганизмов, а справиться с их уничтожением должен иммунитет организма хозяина). Поэтому аминогликозиды проявляют быстрый эффект при большинстве тяжёлых инфекций, вызванных чувствительными к ним микроорганизмами, и их клиническая эффективность гораздо меньше зависит от состояния иммунитета больного, чем эффективность бактериостатиков. Это делает аминогликозиды одними из препаратов выбора при тяжёлых инфекциях, сопряжённых с глубоким угнетением иммунитета, в частности, при фебрильной нейтропении[17].

Аминогликозиды оказывают  бактерицидное действие независимо от фазы размножения микроорганизмов, в том числе и на микроорганизмы, находящиеся в фазе покоя, в отличие от беталактамных антибиотиков, действующих бактерицидно, прежде всего на размножающиеся микроорганизмы. Поэтому терапевтическая эффективность аминогликозидов, в отличие от бета-лактамов, не снижается при одновременном назначении бактериостатически действующих антибиотиков. Для действия аминогликозидов необходимы аэробные условия (наличие кислорода) как внутри бактериальной клетки-мишени, так и в тканях инфекционного очага. Поэтому аминогликозиды не действуют на анаэробные микроорганизмы, а также недостаточно эффективны в плохо кровоснабжаемых, гипоксемичных или некротизированных (омертвевших) тканях, в полостях абсцессов и кавернах. Бактерицидная активность аминогликозидов также сильно зависит от pH среды: они значительно менее эффективны в кислой или нейтральной среде, чем в слабощелочной (при pH около 7.5 или чуть выше). По этой причине эффективность аминогликозидов при инфекциях почек и мочевых путей увеличивается при подщелачивании мочи и снижается при её кислой реакции. Эффективность аминогликозидов при сепсисе (бактериемии), фебрильной нейтропении также увеличивается при одновременной коррекции метаболического ацидоза. При абсцессах, пневмонии эффективность аминогликозидов бывает недостаточной, поскольку в полости абсцесса и в инфицированной лёгочной ткани pH обычно кислый (6.4-6.5). Активность аминогликозидов также снижается в присутствии двухвалентных катионов, в частности, ионов кальция и магния. Поэтому аминогликозиды недостаточно эффективны при остеомиелите (так как костная ткань богата кальцием) и в очагах, подвергшихся кальцификации (обызвествлению). Белки и фрагменты ДНК тканевого детрита, образующегося при нагноении и разрушении тканей, также снижают эффективность аминогликозидов, поскольку аминогликозиды относятся к препаратам, сильно связывающимся с белками. Аминогликозиды не проникают внутрь клеток животных организмов, поэтому не действуют на возбудителей, находящихся внутриклеточно, даже в тех случаях, когда в культуре, in vitro, возбудитель инфекции чувствителен к аминогликозидам. В частности, аминогликозиды неэффективны против шигелл, сальмонелл. Стрептомицин был открыт в 1944 г. благодаря тщательно спланированной программе поиска антибиотиков, активных в отношении грамотрицательных бактерии. Помимо того что он обладает высокой активностью в отношении грамотрицательных бактерий (за исключением некоторых штаммов Proteus и некоторых малочувствительных видов Pseudomonas), стрептомицин в низких концентрациях подавляет рост Mycobacterium tuberculosis. Это первый эффективный препарат для лечения туберкулеза. Он активен также в отношении стафилококков, но стрептококки к нему не очень чувствительны. Как отмечалось выше, он не всасывается при приеме внутрь. При парэнтеральном введении стрептомицин выводится главным образом с мочой и поэтому, как и другие аминогликозидные антибиотики, является ценным препаратом для лечения инфекционных заболеваний мочевых путей[2].

Отрицательные особенности, сильно ограничивающие в настоящее время применение стрептомицина, состоят в следующем:

1) специфическая токсичность в отношении восьмого черепномозгового нерва, что приводит к нарушениям со стороны вестибулярного аппарата, а иногда к глухоте,

2) довольно высокая частота аллергических реакций,

3) высокая частота  появления устойчивых мутантов  и их широкое распространение.

Имеются различные классы мутантов, устойчивых к стрептомицину.

Первый класс составляют мутанты с измененной ЗОS-субчастицей рибосом, которая, как известно, является мишенью этого антибиотика. Эти мутанты не обладают устойчивостью к другим аминогликозидным антибиотикам.

У другого класса мутантов устойчивость обусловлена пониженной проницаемостью клеточной мембраны для антибиотика. Эти мутанты  обладают перекрестной устойчивостью к другим аминогликозидам. Оба этих типа мутантов присутствуют в популяции восприимчивых бактерий с разной частотой и могут отбираться при лечении больных. Наиболее широко распространенный механизм устойчивости состоит, однако, в ферментативной инактивации антибиотика в результате аденилирования или фосфорилирования гидроксильной группы в положении 3 метилглюкозамина и определяется трансмиссивным R-фактором. Это очень большой класс антибиотиков, образуемых некоторыми штаммами Streptomyces, Micromonospora и Bacillus. Все антибиотики этого класса очень близки по своим химическим и биологическим свойствам и по механизму действия. По химической структуре это аминоциклитолы (циклогексан с гидроксильными и амино - или гуанидино-заместителями) с гликозильными заместителями по одной или нескольким гидроксильным группам. Благодаря такой структуре аминогликозиды имеют основные свойства, хорошо растворимы в воде и плохо растворимы в липидах. Отсюда ясно, почему аминогликозидные антибиотики плохо всасываются при приеме внутрь, и их транспорт через бактериальную мембрану, по-видимому, осуществляется за счет специфического активного механизма, а не  результате простой пассивной диффузии.

Аминогликозидные антибиотики  можно разделить на несколько  групп в соответствии с природой аминоциклитола. С химической точки зрения стрептомицин представляет собой сильное органическое основание. Основной характер его обусловлен наличием в молекуле трех группировок: двух гуанидиновых остатков и N-метильной группы сахарного компонента молекулы. Являясь основанием, стрептомицин легко образует соли как с минеральными, так и с органическими кислотами. Соли стрептомицина гигроскопичны, легко растворяются в этиловом спирте и других органических растворителях. В твердом виде соли стрептомицина обладают способностью флюоресцировать в УФ-свете. Характерным свойством стрептомицина является его способность образовывать комплексы с солями некоторых двухвалентных металлов. Наличие в молекуле стрептомицина большого количества гидроксильных и аминных групп обусловливает его высокую гидрофильность (растворимость в воде). Водный раствор основания имеет рН 12,0.  Стрептомицин как в сухом виде, так и в растворах обладает гораздо большей стойкостью, чем пенициллин. Водные растворы его наиболее устойчивы при температуре ниже 28 °С при рН 7—8. Активность антибиотика резко снижается в кислой среде  (рН около 6). Для проявления антибиотического действия стрептомицина слабощелочная среда является более благоприятной.  Препараты стрептомицина, применяемые в медицине, обычно представляют собой соли стрептомицина с серной (сульфат), хлороводородной (гидрохлорид), фосфорной (фосфат) кислотами и др. Применяется также двойная соль трихлоргидрата стрептомицина и хлорида кальция. Соли стрептомицина более устойчивы, чем его основание. Чистые соли стрептомицина в сухом состоянии не теряют активности при хранении их в течение нескольких лет. Активность стрептомицина резко снижается при хранении его при температуре 50 °С или же даже при кратковременном нагревании до 100 °С[5].

4 Механизм действия

4.1 Воздействие на бактериальные клетки

Аминогликозиды образуют необратимые ковалентные связи  с белками 30S-субъединицы бактериальных рибосом и нарушают биосинтез белков в рибосомах, вызывая разрыв потока генетической информации в клетке. Аминогликозиды оказывают бактерицидное действие, которое связано с нарушением синтеза белка рибосомами. Степень антибактериальной активности аминогликозидов зависит от их максимальной (пиковой) концентрации в сыворотке крови[8]. При совместном использовании с пенициллинами или цефалоспоринами наблюдается синергизм в отношении некоторых грамотрицательных и грамположительных аэробных микроорганизмов. Вывод о том, что стрептомицин нарушает функционирование 30S-субчастиц рибосом, основан на следующих экспериментальных данных:

1) радиоактивный стрептомицин связывается с очищенными 30S-субчастицами и не связывается с 50Б-субчастицами;

2) 30S-субчастицы, полученные  из мутантов, устойчивых к стрептомицину, не связывают радиоактивный стрептомицин;

3) ни одна из функций  50S-субчастиц не подавляется стрептомицином.

Анализ субчастиц рибосом, полученных из устойчивых мутантов, показал, что стрептомицин связывается с белком, названным Р10. Связывание антибиотика с этим белком вызывает изменение А-участка 30S-субчастицы, в результате чего нарушается присоединение аминоацил-тРНК в правильной ориентации. Другие аминогликозидные антибиотики также связываются с 30S-субчастицей с участком, близким, но не идентичным участку связывания стрептомицина. Стрептомицин нарушает считывание информации в бесклеточной системе синтеза белка, т. е. он индуцирует включение ошибочных аминокислот в растущую полипептидную цепь. Одно время считалось, что сильнее бактерицидное действие стрептомицина является следствием синтеза нефункциональных белков. Однако, повидимому, это утверждение ошибочно, поскольку добавление стрептомицина к растущей культуре вызывает полное прекращение синтеза белка в пределах нескольких минут, т. е. за время, недостаточное для синтеза заметного количества нефункциональных белков.

Бактерицидное действие антибиотика является скорее следствием высокого сродства стрептомицина к соответствующему участку рибосомы, что приводит к его необратимому связыванию с рибосомами и к необратимой их инактивации[10].

4.2 Фармакологическое действие

Антибиотик группы аминогликозидов  широкого спектра действия. Оказывает бактерицидное действие за счет связывания с 30S субъединицей бактериальной рибосомы, что в дальнейшем приводит к угнетению синтеза белка. Активен в отношении Mycobacterium tuberculosis, а также большинства грамотрицательных бактерий: Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp., Yersinia spp., Haemophilus influenzae, Klebsiella spp. (в том числе Klebsiella pneumoniae), Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Yersinia pestis, Francisella tularensis, Brucella spp. К стрептомицину чувствительны Staphylococcus spp., Corynebacterium diphtheriae. Менее активен в отношении Streptococcus spp. (в том числе Streptococcus pneumoniae), Enterobacter spp. Стрептомицин неактивен в отношении анаэробных бактерий, Spirochaetaceae, Rickettsia spp., Proteus spp., Pseudomonas aeroginosa[7].