Изучение мембранотропности стрептомицина

 

4.3 Антибиотические свойства стрептомицина

 

По отношению к стрептомицину все микроорганизмы условно можно разделить на три группы. Весьма чувствительные микроорганизмы, которые подавляются в большинстве случаев при концентрации стрептомицина 10 мкг/мл. Сюда можно отнести организмы, принадлежащие к родам Bacillus, Brucella, Klebsiella, Мусоbacterium, Васterium и некоторые другие. Умеренно чувствительные микроорганизмы, для подавления которых in vitro необходима концентрация стрептомицина в пределах 10—100 мкг/мл. К этой группе могут быть отнесены многие бактерии из родов Аеrobacter, Соrynebacterium, Diplococcus, Рroteus, Staphilococcus, Streptococcus, Vibrio.

Устойчивые формы микробов, для подавления которых необходима концентрация антибиотика, превышающая 100 мкг/мл. К этой группе относятся роды Bacteroides, Clostridium некоторые виды Proteus, многие виды грибов, дрожжей, риккетсии, вирусы.

Итак, различные организмы по-разному реагируют на присутствие в среде стрептомицина. Степень антимикробного действия антибиотика различна и в отношении различных видов организмов[15].

Наряду с тем, что стрептомицин подавляет рост многих видов микроорганизмов, к нему довольно легко появляется устойчивость, возникают формы бактерий, резистентные к стрептомицину. Повышение устойчивости к стрептомицину в 1000 раз возникает у золотистого стафилококка всего лишь через три пассажа на бульоне с возрастающими концентрациями антибиотика, а у Васt. typhi повышение устойчивости в 22 600 раз происходило после 14 пассажей.

Образование устойчивых форм бактерий к стрептомицину происходит также in vivo. Приобретенная к стрептомицину устойчивость сохраняется у организмов довольно длительное время. С возникновением устойчивости появляются некоторые изменения в характере обмена веществ. Так, у резистентного к стрептомицину хромогенного микроорганизма происходит резкое изменение его окраски. Стрептомициноустойчивая форма синегнойной палочки теряет способность образовывать пигмент, изменяются и некоторые другие особенности обмена. Однако у устойчивых и чувствительных к стрептомицину штаммов бактерий не наблюдается заметных различий в вирулентности.

В ряде случаев под действием стрептомицина в опытах in vitro

возникают не только устойчивые к нему штаммы, но и зависимые от стрептомицина формы, способные развиваться только в присутствии данного антибиотика.

Описаны случаи, когда штаммы менингококка, Мусоb.rаnае и другие микроорганизмы развиваются лишь на среде, содержащей от 100 до 150 мкг/мл стрептомицина[6].

 

4.4 Снижение проницаемости внешних структур

 

Проникновение аминогликозидов  через внешнюю и цитоплазматическую мембраны бактерий является сложным  процессом. Низкая природная чувствительность к аминогликозидам некоторых  микроорганизмов (например, B.cepacia) связана именно с недостаточной проницаемостью для АМП внешней мембраны этих микроорганизмов. Их мутации, приводящие к изменению структуры липополисахарида у E.coli и P.aeruginosa, могут обусловить значительное повышение устойчивости к аминогликозидам.

Природная устойчивость к аминогликозидам анаэробов  объясняется тем, что транспорт  этих антибиотиков через цитоплазматическую мембрану связан с системами переноса электронов, которые у анаэробов  отсутствуют. По этой же причине факультативные анаэробы в условиях анаэробиоза, становятся значительно более устойчивыми к аминогликозидам, чем в аэробных условиях.

Практически важным фактом является природная устойчивость к  аминогликозидам стрептококков  и энтерококков, связанная с преимущественно анаэробным метаболизмом этих бактерий и, соответственно, невозможностью транспорта антибиотиков к чувствительным мишеням. При совместном воздействии на микробную клетку аминогликозидов и β-лактамов последние нарушают структуру цитоплазматической мембраны бактерий и облегчают транспорт аминогликозидов. В результате этого между β-лактамами и аминогликозидами проявляется выраженный синергизм.

Появляются данные о  том, что аминогликозиды могут подвергаться активному выведению из микробной клетки[16].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5 Токсикологические аспекты

 

5.1 Токсические  и лечебные свойства стрептомицина

 

Хотя микробиологические аспекты имеют основное значение, они не являются единственными факторами, которые врач должен принимать во внимание при выборе антибиотика. Необходимо учитывать и многие другие аспекты. В этом разделе мы обсудим возможные побочные реакции, которые могут возникать в результате использования антибиотика. Мы много раз отмечали, что в химическом отношении антибиотики представляют очень разнородную группу веществ, так что никакие токсические или побочные реакции нельзя считать типичными для всех антибиотиков. Противопоказания для каждого семейства антибиотиков необходимо рассматривать отдельно.

Единственными побочными  эффектами, которые можно считать специфичными для всей группы, являются эффекты, связанные с изменением нормальной симбиотической бактериальной флоры. Антибиотики широкого спектра действия, особенно при приеме внутрь, могут вызывать массивную деструкцию кишечной бактериальной флоры, и это может приводить к аномальному развитию нечувствительных микроорганизмов, особенно грибов. Такие случаи называют вторичными инфекциями. Обычно они не слишком тяжелы, но иногда бывают весьма серьезными и требуют лечения. Необходимо отметить, что такое же действие на кишечную флору антибиотик широкого спектра действия может оказывать при внутримышечном или внутривенном введении, если он выделяется с желчью в активной форме. Менее существенным отрицательным результатом изменения кишечной бактериальной флоры является дефицит витаминов, который иногда создается при продолжительном лечении и связан с разрушением бактерий, синтезирующих витамины. Этот недостаток легко устранить, назначив необходимые витамины. Вторичные инфекции, конечно, не ограничиваются кишечным трактом (например, иногда наблюдается вторичная инфекция влагалища трихомонадами), и они редко встречаются при использовании антибиотиков узкого спектра действия, вызывающих менее существенные изменения нормальной бактериальной флоры. Большинство антибиотиков обладает очень низкой токсичностью. Клеточные и молекулярные основы этого свойства, очевидно, связаны с избирательностью действия антибиотиков, обсуждавшейся ранее при рассмотрении механизма действия.

Однако некоторые семейства  антибиотиков вызывают токсические эффекты или обладают характерным побочным действием; широко известны, например, ототоксическое действие аминогликозидных антибиотиков или фотосенсибилизирующее действие тетрациклинов. Ясно, что в клинической практике очень важно учитывать их в качестве возможных противопоказаний. Кроме того, все лекарственные препараты или все чужеродные вещества, вводимые в организм, в том числе и антибиотики, могут стимулировать иммунный ответ с образованием антител и появление аллергических реакций. Частота и интенсивность этих реакций сильно меняется при переходе от одного семейства антибиотиков к другому и бывает совершенно различной для разных членов одного семейства. Аллергические реакции могут принимать различные формы. Наименее серьезны кожные проявления (сыпь и т. д.), которые обычно не требуют прекращения лечения. К более серьезным реакциям относятся повышение температуры и лейкопения, а к тяжелым побочным явлениям—апластическая анемия, ангионевротический отек и анафилактический шок. Больному, у которого хоть раз отмечалась аллергическая реакция к данному антибиотику, никогда нельзя назначать повторно этот препарат или препараты того же семейства, но это не служит противопоказанием к применению антибиотиков других семейств[3].

5.2 Побочные действия

Со стороны мочевыделительной  системы: нефротоксическое действие (альбуминурия, гематурия.)

Со стороны ЦНС и  периферической нервной системы: токсическое  действие на VIII пару ЧМН (потеря слуха, вплоть до развития глухоты, звон, ощущение закладывания в ушах; головокружение, тошнота, рвота, неустойчивость), периферический неврит, неврит зрительного нерва, редко - нервно-мышечная блокада (затруднение дыхания, апноэ, слабость, сонливость).

Со стороны пищеварительной  системы: диарея.

Аллергические реакции: крапивница, зуд, кожная сыпь.

Противопоказано применение при беременности и в период лактации.

Стрептомицин проникает  через плацентарный барьер и может  оказывать нефротоксическое действие на плод человека. У грудных детей, матери которых получали стрептомицин при беременности, возможно развитие глухоты. Выделяется с грудным молоком[4].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6 Материалы  и методы исследований

 

6.1 Исследование липофильности стрептомицина в модельных опытах

 

О мембранотропных свойствах  антибиотика можно судить по физико-химическим свойствам антибиотика и прежде всего по их способности растворяться в липидах, по их липофильности.

Мембранотропное действие антибиотика в значительной мере связано с его поверхностной  активностью, т.е. наблюдаемые эффекты  определяются способностью некоторых  структур молекулы вещества внедряться в липидный слой мембраны. Соединения, молекулы которых частично гидрофильны и частично гидрофобны, называются амфифильными. Типичными представителями амфифильных соединений являются поверхностно-активные вещества (ПАВ).

Благодаря своим амфифильным свойствам молекулы ПАВ будут встраиваться в бислой биологической мембраны своими неполярными углеводородными цепями, вставляя снаружи в водный раствор полярную часть. Адсорбируясь на поверхности, они способны в значительной мере изменять физико-химические свойства мембраны и, в первую очередь, её проницаемость к различным веществам. Характер вызываемой модификации мембранной проницаемости зависит от вида и концентрации химического соединения[17].

Для исследования липофильности  и способности стрептомицина растворяться в липидах биологических мембран измеряли силу поверхностного натяжения водных растворов стрептомицина в системе масло-вода.

Поверхностная активность антибиотика изучалась на моделирующей липидный слой клеточных мембран системе, состоящей из двух несмешивающихся фаз: растительное масло и вода.

Материалы и оборудование: водные растворы антибиотика стрептомицина, растительное масло, раствор сахарозы, раствор метиленового красителя, окуляр-микрометр, микроскоп, стеклянные капилляры, штативы, шланги полиэтиленовые, бюксы стеклянные, груша резиновая, пипетки (2 мл), зажимы, пробирки.

Схема опыта:

Для изучения поверхностной активности использовали метод счета капель.

Для выполнения измерений  собрали прибор, который состоит из штатива, полиэтиленового шланга, мерной пипетки, микрокапилляра и бюкса с растительным маслом. Для определения внутреннего диаметра кончика капилляра заполнили его окрашенным раствором (фуксин, метиленовый краситель). Далее установили капилляр в горизонтальном положении на предметном столике микроскопа и измерили внутренний диаметр с помощью окуляр-микрометра. Закрепили капилляр в лапке штатива в вертикальном положении и присоединили полиэтиленовый шланг.

С помощью резиновой груши заполнили пипетку прибора испытуемым раствором, который поступает через полиэтиленовый шланг в стеклянный капилляр. Кончик капилляра во время опыта должен быть погружен в растительное масло.

Регулируя высоту подъема  пипетки прибора, подобрали интервал между отрывами капель порядка 5 сек.

Определили плотность испытуемого раствора. Для этого точный объем, отмеренный пипеткой (2-3 мл), взвешивали в стеклянном бюксе на аналитических весах. Вычитая массу бюкса, нашли массу испытуемого раствора. Разделив массу на объем, получили значение плотности испытуемого раствора антибиотика.

Далее, подсчитав число  капель и отметив их общий объем по пипетке прибора, определили объем одной капли. Поверхностное натяжение рассчитали по формуле

 

σ_н = g/2πr (ρ₁ – ρ₂) V, (6.1)

 

где g = 980 см/с² (ускорение свободного падения);

r - радиус капилляра (см).

p1 - плотность испытуемого раствора (г/см³);

р2 - плотность растительного масла (0,8 г/см³);

V- объем одной капли (мл);

Величина поверхностной  активности оценивается из концентрационных зависимостей поверхностного натяжения  испытуемых соединений с помощью уравнения Шишковского

 

σ_а = σ _воды – σ _опыт, (6.2)

σ _воды =24,33(г/см²)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6.2 Исследование  трансмембранной токсикокинетики  стрептомицина с помощью биотеста  по физико-химическим свойствам  цитоплазмы

 

Протоплазма - основное содержимое любой живой клетки, своеобразный реактор метаболических реакций. С физико-химической точки зрения протоплазму можно рассматривать как сложную коллоидную систему, обладающую всеми свойствами и признаками макромолекул в растворе. Физико-химические свойства протоплазмы определяют процессы жизнедеятельности клетки.

Движение протоплазмы - один из чувствительных показателей жизнеспособности клетки. Движение протоплазмы в растительных клетках часто называют циклозом.

Рассмотрим классификацию типов движения протоплазмы по Камия.

Колебательное движение - одно из самых неупорядоченных видов движения. Одни частицы - движутся по периферии, другие по направлению к центру клетки, а часть находится в покое. Это движение неустойчивое, имеет случайный характер, однако оно отличается от броуновского. Броуновское движение называется тепловым колебанием молекул, движение протоплазмы - энергией, освобождаемой в процессе метаболизма.

Циркуляционное движение - характерно для клеток, имеющих протоплазматические тяжи, пересекающие вакуоль. Оно легко обнаруживается в крупных клетках волосков Cucurbita, Tradescantia, Glocsinia, водоросли Spirogira, клетках паренхимы лука, ягодах. Органоиды и гранулы крахмала движутся но поверхности или внутри протоплазмы, прилегающей к стенке, а также в тяжах, пересекающих вакуоль. При данном типе движения гранулы разных размеров движутся с разной скоростью, направление непостоянно и часто меняется.-