Ферменты

Одновременно развивалось направление, где в основу классификации ферментов  был положен тип реакции, подвергающейся каталитическому воздействию. Наряду с ферментами, ускоряющими реакции  гидролиза (гидролазы), были изучены  ферменты, участвующие в реакциях переноса атомов и атомных групп (феразы), в изомеризации (изомеразы), расщеплении (лиазы), различных синтезах (синтетазы) и т. д. Это направление  в классификации ферментов оказалось  наиболее плодотворным, так как объединяло ферменты в группы не по надуманным, формальным признакам, а по типу важнейших  биохимических процессов, лежащих  в основе жизнедеятельности любого организма. По этому принципу все  ферменты делят на 6 классов.

1. Оксидоредуктазы - ускоряют реакции окисления - восстановления. 2. Трансферазы - ускоряют реакции переноса функциональных групп и молекулярных остатков. 3. Гидролазы - ускоряют реакции гидролитического распада. 4. Лиазы - ускоряют негидролитическое отщепление от субстратов определенных групп атомов с образованием двойной связи (или присоединяют группы атомов по двойной связи). 5. Изомеразы - ускоряют пространственные или структурные перестройки в пределах одной молекулы. 6. Лигазы - ускоряют реакции синтеза, сопряженные с распадом богатых энергией связей. Эти классы и положены в основу новой научной классификации ферментов.

К классу оксидоредуктаз относят ферменты, катализирующие реакции окисления - восстановления. Окисление протекает  как процесс отнятия атомов Н (электронов) от субстрата, а восстановление - как присоединение атомов Н (электронов) к акцептору.

В класс трансфераз входят ферменты, ускоряющие реакции переноса функциональных групп и молекулярных остатков от одного соединения к другому. Это  один из наиболее обширных классов: он насчитывает около 500 индивидуальных ферментов. В зависимости от характера  переносимых группировок различают  фосфотрансферазы, аминотрансферазы, гликозилтрансферазы, ацилтрансферазы, трансферазы, переносящие одноуглеродные остатки (метилтрансферазы, формилтрансферазы), и др. Например, амидазы ускоряют гидролиз амидов кислот. Из них важную роль в биохимических процессах  в организме играют уреаза, аспарагиназа и глутаминаза.

Уреаза была одним из первых белков-ферментов, полученным в кристаллическом состоянии. Это однокомпонентный фермент (М=480000), молекула его глобулярна и состоит  из 8 равных субъединиц. Уреаза ускоряет гидролиз мочевины до NН₃ и СО₂.

Характерные черты действия ферментов  класса лигаз (синтетаз) выявлены совсем недавно в связи со значительными  успехами в изучении механизма синтеза  жиров, белков и углеводов: Оказалось, что старые представления об образовании  этих соединений, согласно которым  они возникают при обращении  реакций гидролиза, не соответствуют  действительности. Пути их синтеза  принципиально иные.

Главная их особенность - сопряженность  синтеза с распадом веществ, способных  поставлять энергию для осуществления  биосинтетического процесса. Одним  из таких природных соединений является АТФ. При отрыве от ее молекулы в  присутствии лигаз одного или  двух концевых остатков фосфорной кислоты  выделяется большое количество энергии, используемой для активирования  реагирующих веществ. Лигазы же каталитически  ускоряют синтез органических соединений из  активированных за счет распада  АТФ  исходных продуктов. Таким образом, к лигазам относятся ферменты, катализирующие соединение друг с другом двух молекул, сопряженное с гидролизом пирофосфатной связи в молекуле АТФ или иного нуклеозидтрифосфата.

Механизм действия лигаз изучен еще недостаточно, но, несомненно, он весьма сложен. В ряде случаев доказано, что одно из участвующих в основной реакции веществ сначала дает промежуточное соединение с фрагментом распадающейся молекулы АТФ, а вслед  за этим указанный промежуточный  продукт взаимодействует со вторым партнером основной химической реакции  с образованием конечного продукта.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ii. Применение  ферментов в пищевых технологиях

2.1 Применение в пищевых технологиях

 

Человечество  использует ферменты для приготовления  продуктов питания с незапамятных времен. Эмпирическим путем люди выяснили, что существуют природные субстраты, которые при внесении их в тот  или иной вид сырья вызывают в  нем желательные изменения.

Такими субстратами были соки растений и ткани животных, содержащие ферменты, а также виноградный сок, молоко, тесто, самопроизвольно сбродившие в результате попадания в них  микроорганизмов. Например, для получения  сыра использовали соки растений, содержащие фермент фицин, или ткани желудка  птиц и животных, содержащие фермент  ренин. Для тендеризации мяса (размягчения  мышечной ткани) использовали сок папайи, содержащий фермент папайи.

Изучать ферменты начали в XVIII в.. когда  были открыты пищеварительные ферменты, выделены ферменты из биологических  объектов: пероксидаза из хрена, и  α-амилаза из зерна и др. В ХIX в. получены первые чистые формы ферментов  и предложен термин «энзим» (от греч, enzymos - связанный с брожением теста).     

Возникновение энзимологии как  самостоятельной научной дисциплины стало возможным с развитием химии, биологии и медицины.При изучении механизма действия ферментов было высказано предположение, что ферменты образуют комплексы с субстратами. Для объяснения пространственного взаимодействия между ферментом и субстратом Э. Фишер предложил модель «ключ к замку».  
Наибольший вклад в развитие энзимологии был сделан в XX в. Были разработаны теория фермент-субстратного комплекса и первая математическая модель для описания ферментативной кинетики. Однако вопрос о том. как ферменты ускоряют химические реакции, оставался не выясненным до возникновения теории переходного состояния. В 1948 г. Л. Полинг предположил, что каталитическое действие ферментов достигается стабилизацией переходного состояния химических реакций путем взаимодействия с активным центром фермента, что было в дальнейшем подтверждено экспериментально. В 50-60 гг. XX в. был пересмотрен вопрос субстратной специфичности ферментов. Согласно гипотезе «индуцированного соответствия» (модель Кошланда) ферментная активность может регулироваться небольшими молекулами, отличными от молекул субстрата или продуктов реакции. Было показано существование аллостеричных ферментов, разработаны методы регуляции активности ферментов. Было установлено, что катализ тесно связан с молекулярными взаимодействием между молекулами субстрата и компонентами молекул фермента, а природа и последовательность этих взаимодействий определяются механизмом реакции.  
        Начало изучения структуры ферментов было положено работой Д. Самнера, который впервые установил белковую природу ферментов. За 20 лет, прошедших после его открытии, было описано более 130 кристаллических ферментов.

В середине XX в. методы рентгеновской  кристаллографии и ядерно-магнитного резонанса стали использовать для  изучения каталитических свойств ферментов  и особенностей фермент-субстратных  взаимодействий.  
          В конце столетия появилась возможность открывать и создавать новые ферменты, ранее не существовавшие в природе, получать микроорганизмы-продуценты ферментов с необходимыми для человека свойствами, идентифицировать ранее неизвестные ферменты, изучить их и модифицировать: изменять аминокислотную последовательность первичной структуры ферментов, а также модифицировать химические группы ферментов, участвующие в образовании фермент-субстратного комплекса.  
         Достижения современной энзимологии значительно расширили возможности применения ферментов в первую очередь в медицине и пищевой промышленности, где их используют практически во всех отраслях(табл.1).  
          Это обусловлено их преимуществами по сравнению с химическими катализаторами: избирательностью и стерео-специфичностью действия, возможностью достижения высоких скоростей превращения субстратов при относительно мягких условиях технологии, безвредностью для окружающей среды и человека.

Ферменты не являются чужеродными  для организма человека веществами. В пищевых технологиях используют в основном ферменты, присутствующие в пищевом сырье, которые поступают  в организм человека при потреблении  свежих фруктов и овощей, орехов, молока, сброженных и консервированных продуктов. В пищевых продуктах  ферментов содержится мало - миллиграммы  на килограмм продукта. При кулинарной и технологической обработке  пищевых продуктов ферменты, как  правило, инактивируются. Продолжается поиск новых возможностей использования  ферментов в пищевой промышленности.     Основными направлениями исследования являются:  
• модификация свойств индивидуальных ферментов с целью повышения их активности и удешевления целевых продуктов;  
• скрининг новых микроорганизмов-продуцентов ферментов;  
• получение новых рекомбинантных ферментов с заданными свойствами;  
• применение ферментативных реакций для получения ценных пищевых ингредиентов и биологически активных веществ;  
• разработка пищевых нанотехнологий с использованием ферментов.  
Современные методы модификации ферментов позволяют увеличивать стойкость ферментов к действию различных химических реагентов и ингибиторов, рН, температурному воздействию; изменять рН оптимума ферментов, их субстратную специфичность и связывающие свойства; регулировать предпочтения определенных металлов-кофакторов и каталитические свойства ферментов.  
Химическая модификация - наиболее известный вид модификации ферментов . Ее методы должны отвечать следующим требованиям:  
• используемые химические реагенты должны быть безвредными (особенно в случаях дальнейшего использования ферментов в пищевых технологиях);  
• условия модификации не должны быть жесткими, приводящими к ухудшению свойств ферментов; модифицированные ферменты должны отделяться от реакционной среды относительно простыми и недорогими способами;  
• применение модифицированных ферментов должно быть экономически выгодным.

       

Отрасль	Этапы технологически» процессов  и технологические цели применения ферментов
Технология переработки зерна	Повышение выхода муки и круп, улучшение  качества клейковины, производство модифицированной муки зернобобовых
Хлебопечение	Сокращение расхода муки, улучшение  теста, замедление черстеения изделий, улучшение цвета корочки, производство охлажденного и замороженного теста
Пивоварение	Использование неосоложенного сырья, разжижение, усиление ферментируемое™, улучшение  фильтрации, контроль содержания азота, получение низкокалорийного пива, стабилизация пива
Технология молочных продуктов	Коагуляция молока, замена сычужного  фермента в производстве сыра, модификация  молочного белка, создание сырного  аромата, получение ферментативно  модифицированных сыров, удаление перекиси водорода, получение молочного сахара
Производство вина, фруктовых соков, газированных напитков, консервов	Осветление, мацерация сырья, удаление крахмала из сока, увеличение выхода, получение  сладких ликеров, стабилизация вин  и соков, производство соков с  мякотью и пюре
Переработка крахмала	Увеличение выхода, модификация крахмала, разжижение, осахаривание, получение  глюкозо-фруктовых и зерновых сиропов
Спиртовая промышленность	Конверсия сырья, разжижение крахмала, осахаривание, улучшение роста дрожжей, увеличение выхода спирта
Производство кофе	Сепарация зерен, контроль вязкости зкетрактов, улучшение вкуса и аромата
Производство белков	Гидролиз белков и полисахаридов, снижение вязкости, производство модифицированных пептидов и белков
Производство сахара	Удаление крахмала, белков и полисахаридов
Производство ароматизаторов	Синтез тонких ароматов, получение  натуральных ароматических эфиров и т. д.
Производство масел и жиров	Увеличение выхода, модификация жиров, экстракция масла, получение биологически активных веществ (лецитина, токоферолов, каротинов и др.)
Технология мясопродуктов	Увеличение выхода, тендеризация мыса, получение мясных экстрактов, текстуризация  белков, продление сроков хранения
Производство растительных экстрактов	Увеличение экстрактивности, сокращение длительности экстракции, улучшение  фильтрации, повышение выхода пигментов, производство чая и чайных экстрактов,

 

Примером химической модификации  служит модификация ферментов в  условиях неполярной (не водной) среды. Происходящее при этом снижение активности воды в реакционной системе существенно  изменяет свойства ферментов: реакция  сдвигается в сторону синтеза; образуются оптически активные продукты; повышается термостабильность фермента и стабильность при хранении; фермент приобретает  способность катализировать новые  реакции, не протекающие в водной среде (синтез пептидов, алифатических  амидов и др.); ферменты проявляют  активность в органических растворителях  при температуре выше 100 °С. Данный способ химической модификации использован  при модификации таких ферментов, как липазы, химотрипсин , трипсин, субтилизин , термолизин , полифенолоксидазы , глюкоамилазы , папаин , химозин . С помощью физико-химических методов модификации изменяют силы электростатического взаимодействия, водородные связи и гидрофобные взаимодействия в молекулах белков.

Например, широко используемый для  изомеризации глюкозы в фруктозу фермент ксилозоизомераза модифицируется в направлении увеличения его  термостабильности, снижения значения рН оптимума, изменения предпочтения активирующего катиона металла, изменения субстратной специфичности  от ксилозы к глюкозе. К активно  развивающимся областям энзимологии  относится разработка биологических  методов модификации ферментов. Особенно многообещающим является направление, получившее название «белковая инженерия». Методы белковой инженерии, основанные на знании зависимости между аминокислотной последовательностью, трехмерной структурой и каталитической активностью ферментов, позволяют успешно модифицировать ферменты для улучшения их технологических  свойств. Широко используется способ замены определенных аминокислот в структурах .молекул ферментов.

Показано, что замена в молекуле фосфолипазы А2 Asn89 на Asp и Glu92 на Lys вблизи N-терминального конца спирали 5 увеличивает  ккал/моль , а замена Asp56 на Ser, Ser60 на Gly и Asn67 на Туr значительно увеличивает  активность и средство фосфолипазы  А2 к фосфолипидным мицеллам . Путем  замены аминокислот в структурах молекул ферментов изменяют также  их субстратную специфичность . Изменение  соотношения активности к растворимому и нерастворимому субстратам у целлобиогидролаз достигается путем замены внешних  остатков ароматических аминокислот, которые захватывают конец молекулы полисахарида и направляют ее внутрь активного центра. Увеличение стабильности ферментов к температуре и  экстремальным значениям рН достигается  путем таких замен среди сближенных в его третичной структуре  аминокислотных остатков, которые приводят к образованию дополнительных нековалентных  гидрофобных связей, солевых мостиков или ковалентных S-S-связей, повышающих общую стабильность глобулы молекулы фермента. Во многих случаях замены осуществляются на основе сопоставления  совершенствуемых структyp с соответствующими структурами аналогов из экстремофильных  родственных организмов (термо-, ацидо- и алкалофильных).