Ферменты

        Иногда повышение стабильности ферментов достигается введением в его структуру специального термостабилизующего модуля, обнаруженного у некоторых бактерий.  
          Повышение стабильности ферментов к протеолизу осуществляется либо путем удаления сайтов узнавания протеаз из структуры доменов, либо путем увеличения степени гликозилирования через введение в них аминокислот; служащих сайтами О- или N-гликозилирования.  
          Модификация ферментов осуществляется также с помощью изменения их модульной структуры путем включения или удаления субстратсвязывающего домена. Например, в результате введения в молекулы гликозилтрансфераз целлюлозосвязывающего домена они приобретают способность «сшивать» оборванные концы молекул в аморфных участках на поверхности целлюлозного волокна. Удаление «ненужных» модулей уменьшает массу молекулы, в результате чего повышается эффективность диффузии фермента в субстрат. Изменение характера действия и субстратной специфичности ферментов достигается, например, делецией петель, перекрывающих активный центр экзогидролаз, что превращает их в родственные эндогидролазы .  
           Один из видов биологической модификации - знзиматическая модификация ферментов. Ферменты используют для модификации протеинов уже более 20 лет.

В пищевых технологиях ферменты используются для регулирования  функционально-технологических и  нутритивных свойств белков , а  также для регулирования функционально-физиологических  свойств пищевых белков. В 90-х  гг XX в. ферменты начали использовать для  модификации других ферментов.

Сложность осуществления таких  реакций обусловлена стерическими факторами, затрудняющими взаимодействие молекул ферментовОдним из немногочисленных примеров подобной модификации является модификация фосфолипазы А2 тканевой трансглутаминазой .

Все шире используются в качестве продуцентов ферментов генетически  измененные микроорганизмы. Модификация  их генома производится с целью увеличения гиперпродукции продуцируемых этими  микроорганизмами ферментов или  создания возможности синтеза нехарактерных  для данного микроорганизма ферментов.  

С целью увеличения гиперпродукции ферментов микроорганизмы подвергают воздействию различных мутагенов (ультрафиолетовых и рентгеновских лучей, химических агентов), вызывающих как гибельную мутацию у большей части микробной популяции, так и мутации, способствующие увеличению продукции ферментов.Для каждого мутагена и микроорганизмы подбирают условия мутагенной обработки, позволяющие увеличить количество выживших мутировавших клеток. Оставшиеся жизнеспособными микробные клетки подвергают скринингу по геномным вариантам, отбирая наиболее активных продуцентов определенныхферментов.

Данный метод, называемым методом  классической мутации, впервые был  описан в конце 30-х гг. XX в, и активно  использовался в 1950-1970 гг. Ему на смену пришли методы модификации  генома микроорганизмов, основанные на достижениях генной инженерии. В  частности рекомбинантная ДНК (рДНК) технология, позволяющая внедрять в  геном микроорганизма гены, ответственные  за синтез необходимых ферментов. В  настоящее время налажено промышленное производство микроорганизмов-продуцентов  рекомбинантных ферментов. Например, ген, ответственный за выработку фермента химозина, выделенный из эукариотического организма, внедряют в геном микроорганизмов Escherihia coli, Kluyveromyces lactis или Aspergillus awamori, которые  становятся продуцентами данного фермента .

Бактерии Bacillus subtilus используют как  продуценты рекомбинантного фермента ацетолактатдекарбоксилазы . Использование  микроорганизмов-продуцентов рекомбинантных ферментов имеет ряд преимуществ. Один и тот же микроорганизм может  использоваться как продуцент различных  ферментных препаратов, что унифицирует  технологию их получения. Выход ферментов  значительно увеличивается, например выход глюкоамилазы и эндоксиланазы. продуцируемых рекомбинантными  штаммами Aspergillus. превышает выход  этих ферментов из традиционных штаммов в 10-30 раз.

Рекомбинантные ферменты отличаются высокой чистотой, что имеет особое значение в пищевых технологиях. Например, использование свободных  от протеазной активности амилаз в  хлебопечении позволяет улучшить реологические  свойства теста, поскольку не происходит разрушения структуры белков клейковины.  
Рекомбинантные ферменты широко применяются в пищевых технологиях.Однако, если в непищевых отраслях промышленности рекомбинантные ферменты применяют без ограничений, то пищевые продукты, полученные с использованием рекомбинантных ферментов, должны быть соответственно маркированы для информирования потребителя.

Кроме как из природных источников, ферменты могут быть получены путем  искусственного синтеза. Перспективен синтез ферментов, не имеющих полипептидных  структур, но содержащих аналоги активных центров существующих ферментов. Созданы  ферменты, содержащие синтетические  полимеры циклодекстринов и металлопроизводных стероидов, являющиеся матриксом, в  котором дополнительные реакционные  группы ориентированы как активные центры ферментов .

Циклодекстрины широко используются для создания синтетических ферментов, поскольку способны к гидрофобному связыванию в центральной полости  активных соединений. На основе β-циклодекстрина получены различные синтетические  гидролитические ферменты , ферменты с химотрипсиновой , трансамилазной и рибонуклеазной активностью [37, 38]. Синтетический химотрипсин был  получен путем включения в  молекулу β-циклодекстрина каталитических групп - имидозолилбензоиной кислоты  или других имидазольных соединений.

Поскольку синтетические ферменты не содержат аминокислотных остатков, они менее подвершены действию таких  факторов, как температура, рН, ионная сила, чем природные ферменты, для  конформационной стабильности и  биологических функций которых  данные факторы являются лимитирующими . Эти свойства синтетических ферментов  расширяют возможности ферментативных технологий, в том числе и в  пищевой промышленности.

2.2 Иммобилизованные ферменты

ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ ФЕРМЕНТЫ (от лат. immobiiis - неподвижный), препараты ферментов, молекулы которых связаны с матрицей, или носителем (как правило, полимером), сохраняя при этом полностью или частично свои каталитич. свойства. Иммобилизованные ферменты обычно не растворяются в воде; между двумя фазами возможен обмен молекулами субстрата, продуктов каталитических. реакции, ингибиторов и активаторов.

Коммерческое использование ферментов  ограничено рядом факторов. Важнейшие  из них - нестабильность ферментов и  их высокая стоимость. Стоимость  можно существенно снизить за счет иммобилизации фермента. Это означает, что фермент закрепляют на поверхности или внутри твердой подложки, которую легко удаляют из реакционной смеси после завершения ферментации. Фермент может быть использован повторно, что существенно снижает стоимость процесса.

Другое преимущество иммобилизации  заключается в том, что фермент  становится более стабильным, вероятно, за счет ограничения его способности  денатурировать при изменениях рН, температуры и растворителей. К  примеру, иммобилизованная глюкозоизомераза стабильна при 65°С в течение года, тогда как в растворе она денатурирует при 45 °С за несколько часов.

Иммобилизованный фермент можно  использовать для непрерывного (открытого) производства, пропуская реагенты через  фермент и собирая продукт  на конечном этапе.

2.3 Методы иммобилизации ферментов

Существуют различные способы  иммобилизации ферментов. Они включают либо механическое включение (захват) фермента, либо его присоединение  к определенной структуре, или матрице. Преимуществом метода захвата является то, что фермент сохраняется в  естественном состоянии. Однако крупным  молекулам трудно добраться до фермента.

Физическая иммобилизация ферментов  представляет собой включение фермента в такую среду, в которой для  него доступной является лишь ограниченная часть общего объема. При физической иммобилизации фермент не связан с носителем ковалентными связями. Существует четыре типа связывания ферментов:

- адсорбция на нерастворимых  носителях;

- включение в поры геля;

- пространственное отделение фермента  от остального объема реакционной  системы с помощью полупроницаемой  перегородки (мембраны);

- включение в двухфазную среду,  где фермент растворим и может  находиться только в одной  из фаз.

Для иммобилизации ферментов в  геле существует два основных способа. При одном из них фермент помещают в водный раствор мономера, а затем  проводят полимеризацию, в результате чего образуется полимерный гель с  включенными в него молекулами фермента. В реакционную смесь часто  добавляют также бифункциональные (содержащие в молекуле две двойные  связи) сшивающие агенты, которые  придают образующемуся полимеру структуру трехмерной сетки. В другом случае фермент вносят в раствор готового полимера, который затем каким-либо образом переводят в гелеобразное состояние. Способ иммобилизации ферментов путем включения в полимерный гель позволяет создавать препараты любой геометрической конфигурации, обеспечивая при этом равномерное распределение биокатализатора в объеме носителя. Метод универсален, применим для иммобилизации практически любых ферментов, полиферментных систем, клеточных фрагментов и клеток. Фермент, включенный в гель, стабилен, надежно защищен от инактивации вследствие бактериального заражения, так как крупные клетки бактерий не могут проникнуть в мелкопористую полимерную матрицу. В то же время, эта матрица может создавать значительные препятствия для диффузии субстрата к ферменту, снижая каталитическую эффективность иммобилизованного препарата, поэтому для высокомолекулярных субстратов данный метод иммобилизации не применим вообще.

Захват шариками альгината легко  продемонстрировать на лабораторных занятиях; он является наиболее распространенным промышленным методом. Раствор, содержащий фермент и альгинат натрия, по каплям вносят в раствор хлористого кальция. Как только капельки вступают в контакт  с хлористым натрием, они немедленно начинают превращаться в гель; при  этом образуются идеальные по форме  шарики геля, содержащие внутри захваченный  фермент. Для длительного использования  гель можно стабилизировать полиакриламидом  или приготовить его в виде пластин, если поместить его на тканевую основу.

Главным отличительным признаком  химических методов иммобилизации  является то, что путем химического  взаимодействия на структуру фермента в его молекуле создаются новые  ковалентные связи, в частности  между белком и носителем. Препараты  иммобилизованных ферментов, полученные с применением химических методов, обладают по крайней мере двумя важными  достоинствами. Во-первых, ковалентная  связь фермента с носителем обеспечивает высокую прочность образующегося  конъюгата. При широком варьировании таких условий, как рН и температура, фермент не десорбируется с носителя и не загрязняет целевых продуктов  катализируемой им реакции. Это особенно важно при реализации процессов  медицинского и пищевого назначения, а также для обеспечения устойчивых, воспроизводимых результатов в  аналитических системах. Во-вторых, химическая модификация ферментов  способна приводить к существенным изменениям их свойств, таких как субстратная специфичность, каталитическая активность и стабильность.

2.4 Применение иммобилизованных ферментов

Лучшим примером процесса, в котором  успешно используются иммобилизованные ферменты, является производство кукурузного  сиропа с высоким содержанием  фруктозы. Он широко используется в  США и Японии в качестве подсластителя, например, во фруктовых напитках, так  как он значительно дешевле сахарозы. Сироп готовят из относительно дешевого источника углеводов - крахмала, получаемого  из кочерыжек кукурузных початков. Процесс осуществляется с участием трех ферментов. Сначала получают крахмальную  массу путем перемалывания (растирания) кукурузы, затем две амилазы превращают крахмал в глкжозный сироп. Обесцвеченный  и сконцентрированный сироп добавляют  в различные пищевые продукты и напитки. С помощью фермента глюкозоизомеразы можно превратить этот сироп в смесь, содержащую равные количества глюкозы и фруктозы. Для этого сироп пропускают через колонку, в которой содержится фермент, иммобилизованный путем адсорбции на целлюлозном ионообменнике. Активность фермента со временем постепенно снижается, поэтому обычно используют несколько колонок, работающих одновременно. Фруктоза слаще глюкозы, хотя обе содержат одинаковое число калорий на единицу массы. Это означает, что, используя кукурузный сироп с высоким содержанием фруктозы, можно получить такой же сладкий продукт как с глюкозой, но с меньшим количеством калорий. Ежегодно в США производится около 4 млн. тонн сиропа.