Хромотография

Общие фармакопейные статьи

МЕТОДЫ АНАЛИЗА

ФИЗИЧЕСКИЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ 
МЕТОДЫ АНАЛИЗА

1. хроматогрАфия (ОФС 42-0092-09)

Хроматографией называется физико-химический метод разделения смесей, в котором разделяемые компоненты распределены между двумя фазами. одна из этих фаз (стационарная фаза) неподвижна, а другая (подвижная фаза) постоянно движется в определенном направлении.

по свойствам подвижной и неподвижной фаз хроматографические методы можно разделить на следующие типы, показанные на схеме (рис. 1.1).

Рис. 1.1. Типы хроматографии

Результат хроматографического разделения представляется в виде хроматограммы.

Хроматограмма и хроматографичеcкие параметры

Хроматограммой называют последовательность пятен, зон или пиков, соответствующих компонентам исходной смеси после их хроматографического разделения. Для любого типа хроматографического процесса (см.  
рис. 1.1), в котором для регистрации результата используется детектор, хроматограмма представляет собой график зависимости сигнала детектора, пропорционального концентрациям разделяемых компонентов, от времени (колоночная хроматография) или расстояния (планарная хроматография). В планарной хроматографии хроматограммой называют также зафиксированную на бумаге (бумажная хроматография) или на ТСХ-пластинке (тонкослойная хроматография) последовательность пятен компонентов исходной (анализируемой) смеси.

Схема типичной хроматограммы приведена на рис. 1.2. Хроматограмма состоит из пиков, разделенных базовой линией.

Базовая линия соответствует сигналу только от подвижной фазы.

Пик – кривая, в идеале приближающаяся к кривой гауссова распределения, которая описывает постепенное нарастание концентрации вещества и последующее ее уменьшение.

 

Расчет содержания определяемого компонента

Существуют 3 основных метода расчета концентрации анализируемого компонента по хроматографическим данным.

1. Метод  нормирования (метод внутренней нормализации, нормировки).

Применение данного метода основано на предположении, что на хроматограмме зарегистрированы все компоненты, входящие в состав анализируемой смеси, и что доля площади (высоты) каждого пика от суммы площадей (высот) всех пиков соответствует содержанию компонента в массовых процентах.

2. Метод внешнего  стандарта. Готовят раствор стандартного образца определяемого компонента с концентрацией, близкой к предполагаемой концентрации этого компонента в испытуемой пробе. Последовательно хроматографируют стандартный, испытуемый и снова стандартный растворы (каждый не менее 3-х раз). Находят средние значения площадей пиков на хроматограммах и рассчитывают концентрацию определяемого компонента в испытуемом растворе

Для проведения анализа методом внешнего стандарта необходимо предварительно убедиться, что в используемом диапазоне концентраций площадь пика определяемого компонента линейно зависит от его концентрации.

3. Метод внутреннего стандарта. Метод внутреннего стандарта основан на том, что в анализируемую смесь вводят определенное количество стандартного вещества (внутренний стандарт). Это вещество должно быть химически инертным, отсутствовать в анализируемом образце и полностью отделяться от других компонентов смеси. время его удерживания должно быть близким к ti определяемых компонентов, концентрация должна быть близка к концентрациям определяемых компонентов, пик симметричным.

В испытуемый и стандартный растворы вводят равные количества внутреннего стандарта, хроматографируют и определяют отношения площадей (высот) пиков определяемого компонента к площади (высоте) пика внутреннего стандарта в испытуемом и стандартном растворах.

 

 

1.2. ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ (ОФС 42-0094-09)

Хроматографический процесс в тонком слое сорбента, нанесенном на инертную твердую подложку (стеклянную, металлическую или полимерную), называется тонкослойной хроматографией или хроматографией в тонком слое сорбента (ТСХ).

Разделение может осуществляться по нескольким механизмам: адсорбционному, распределительному, ион-парному, ионообменному, эксклюзионному (гель-проникающему), хиральному или какой-либо их комбинации.

В результате движения анализируемого вещества и элюента под действием капиллярных сил происходит разделение смеси исследуемых веществ на ее компоненты. При разделении вещества образуют на поверхности сорбента круглые или эллипсовидные пятна или полосы (хроматографические зоны).

Испытание на подлинность (идентификация) анализируемых веществ проводится при одновременном хроматографировании одинакового количества анализируемого вещества и стандартного образца на одной и той же хроматограмме. При этом если вещества идентичны, то соответствующие им хроматографические зоны имеют одинаковую форму, интенсивность поглощения или окраски и равные величины Rf.

При испытаниях на чистоту основное вещество и примеси в условиях хроматографирования должны иметь разные значения Rf. При этом можно судить о степени чистоты анализируемого вещества по величине и интенсивности пятен обнаруживаемых на хроматограмме примесей. Их содержание может быть определено полуколичественно. Для этого на пластинку наносят определенные количества анализируемого вещества и свидетелей. Для определения идентифицированных примесей в качестве свидетелей используют стандартные образцы идентифицированных примесей в количествах, соответствующих их предельному содержанию. Для определения неидентифицированных примесей чаще всего используют растворы сравнения, приготовленные путем разведения испытуемого раствора, как указано в частной фармакопейной статье. Содержание примеси в анализируемом веществе оценивают, сравнивая зону примеси по совокупности величины и интенсивности с соответствующими пятнами свидетеля.

Количественное определение веществ на хроматограмме проводят, как правило, денситометрически.

Основные приборы и материалы:

– пластинки с закрепленным слоем сорбента различных модификаций;

– хроматографические камеры;

– калиброванные капилляры и микрошприцы;

– устройства для нанесения на хроматограммы обнаруживающих реаген-тов (пульверизаторы для опрыскивания, камеры для погружения хро-матограмм в раствор и др.);

– вещества-стандарты, растворители, реагенты для обнаружения хрома-тографических зон;

ультрахемископы с УФ-лампами на 254 нм и 365 нм.

Используемая лампа должна удовлетворять следующему тесту.

Проверка работы лампы. На пластинку силикагель G наносят 5 мкл 0,04 % раствора натрия салицилата в спирте 96 % для ламп с максимумом излучения при 254 нм или 5 мкл 0,2 % раствора натрия салицилата в спирте  
96 % для ламп с максимумом излучения при 365 нм в виде пятна диаметром около 5 мм; пятно должно светиться.

При проведении анализов расстояние между лампой и хроматографической пластинкой не должно превышать расстояния, используемого при проверке работы лампы.

Примечание. Используемый спирт должен быть свободен от флуоресцирующих веществ.

Хроматографические пластинки

Пластинка для ТСХ представляет собой твердую подложку (стеклянную, металлическую или полимерную) с нанесенным слоем сорбента. Толщина слоя сорбента от 0,1 до 0,25 мм для аналитического варианта и от 0,5 до 2,0 мм для препаративного.

Готовые хроматографические пластинки могут содержать флуоресцирующий индикатор для детектирования веществ, поглощающих в УФ-области спектра при 254 и 365 нм.

Размер частиц сорбента для аналитического варианта ТСХ составляет 5–20 мкм. Наряду с такими пластинками можно использовать высокоэффективные хроматографические пластинки, содержащие сорбент с частицами размером 5–7 мкм. Такие пластинки позволяют увеличить эффективность разделения и уменьшить предел обнаружения хроматографических зон.

выпускаются также пластинки с монолитными сорбентами и пластинки с концентрирующей зоной (двухфазовые пластинки). Последние используются в фармацевтическом анализе для разделения сложных и гетерогенных смесей (экстракты из растительного лекарственного сырья, растворы таблеток со вспомогательными компонентами, мягкие лекарственные формы, смеси, содержащие пигменты, суспензии, растворы сухих экстрактов и др.).

Хроматографические камеры

Используют хроматографические камеры для вертикального или горизонтального элюирования с герметичными крышками. Камеры для горизонтального элюирования снабжены также устройствами для подачи элюента на пластинку. Перед проведением анализа обычно внутренние стенки камеры обкладывают фильтровальной бумагой, смоченной подвижной фазой. Для вертикального элюирования применяют камеры с перегородкой в центре дна.

Использование камеры для горизонтального элюирования позволяет осуществлять одновременное элюирование с противоположных сторон пластинки, что увеличивает производительность анализа в два раза по сравнению с использованием камеры для вертикального элюирования. при этом также уменьшается расход подвижной фазы приблизительно в 10 раз. В горизонтальной камере движение подвижной фазы по пластинке происходит только за счет капиллярных сил, вклад гравитации при этом отсутствует, что повышает эффективность разделения по сравнению с камерами для вертикального элюирования.

Подвижные фазы (ПФ)

Подвижные фазы (элюенты) должны быть предпочтительно малотоксичными, содержать минимум компонентов, не вступать в химические реакции ни с сорбентом (НФ, неподвижной фазой), ни с компонентами разделяемой смеси. ПФ должны также достаточно быстро испаряться с поверхности хроматограмм после элюирования.

Для подавления диссоциации полярных молекул компонентов разделяемой смеси к ПФ добавляют вещества кислого или основного характера (модификаторы).

Нанесение проб

Если это указано в частных фармакопейных статьях, пластинки предварительно промывают растворителем и активируют нагреванием в течение 1 ч при 100–105 °С в сушильном шкафу. Перед нанесением проб пластинки должны храниться в герметично закрытом эксикаторе. Нанесение проб осуществляют:

– калиброванными капиллярами с тупым концом;

– поршневыми микрошприцами с тупым концом иглы;

– полуавтоматическими или автоматическими аппликаторами.

Нанесение осуществляют двумя способами: в виде пятен (2–5 мм диаметром) с промежутками между пятнами не менее 10 мм и в виде полос длиной от 10 до 20 мм с промежутком между ними не менее 10 мм. Расстояние линии старта от нижнего края пластинки должно составлять не менее 10 мм. Во избежание «краевых эффектов» размывания фронта ПФ в процессе элюирования перед нанесением проб соскабливают с обеих боковых сторон пластинки слой сорбента шириной 2–3 мм. Расстояния на стартовой линии от боковых краев пластинки до мест нанесения первой и последней проб должны составлять не менее 10 мм. В процессе нанесения проб недопустимо повреждение сорбента на линии старта. Подсушивание нанесенных проб осуществляют в токе холодного или теплого воздуха, либо на специальном столе с электроподогревом.

Способы элюирования

Используют следующие способы элюирования: восходящее элюирование (одно- и многоступенчатое, одномерное и двумерное – с поворотом пластинки на 90° или 180°) и горизонтальное.

Восходящая хроматография

Если не указано иначе в частной фармакопейной статье, пластинку с нанесенными пробами помещают вертикально в камеру, предварительно насыщенную парами ПФ в течение 1 ч при 20–25 °С. уровень ПФ должен быть расположен ниже линии старта. Камеру закрывают и проводят процесс при 20–25 °С в защищенном от света месте. После прохождения фронта ПФ расстояния, указанного в частной фармакопейной статье, пластинку вынимают из камеры, сушат и проявляют в предписанных условиях.

При проведении двумерной хроматографии пластинку высушивают после хроматографирования в первом направлении и хроматографируют в направлении, перпендикулярном первому.

Горизонтальная хроматография

Пластинку с нанесенными пробами помещают в камеру и направляют поток ПФ из лотка в камеру согласно инструкции к прибору для горизонтального элюирования. Процесс проводят при 20–25 °С (если это указано в частной фармакопейной статье, одновременно с противоположных сторон пластинки). Когда ПФ пройдет расстояние, указанное в частной фармакопейной статье, пластинку вынимают, сушат и проявляют в предписанных условиях.

Двумерную хроматографию выполняют как указано в разделе «Восходящая хроматография».

Способы обнаружения

Обнаружение (детектирование) хроматографических зон после проведения качественной и полуколичественной ТСХ осуществляют следующими способами:

– наблюдением под УФ-светом;

– опрыскиванием растворами обнаруживающих реагентов;

– выдерживанием в парах обнаруживающего реагента;

– погружением в растворы обнаруживающих реагентов в специальных камерах.

Высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ)

Эффективность разделения увеличивается как вследствие увеличения площади раздела подвижной и неподвижной фазы за счет уменьшения диаметра частиц сорбента, так и благодаря большей однородности размеров этих частиц. Применяют ВЭТСХ-пластинки, выполненные как в нормально-фазовом (полярная НФ), так и в обращенно-фазовом (неполярная НФ) вариантах.

По сравнению с классической ТСХ использование высокоэффективных пластинок позволяет:

– увеличить число анализируемых проб за счет уменьшения диаметра стартовых пятен (до 1–2 мм) или длины полос (до 5–10 мм);

– уменьшить промежутки между стартовыми пятнами (до 5 мм);

– уменьшить время хроматографирования за счет уменьшения пробега фронта подвижной фазы (ПФ);

– уменьшить расход (объем) ПФ;

– снизить пределы обнаружения пятен и количественного определения определяемых веществ в 10–100 раз.