Автор работы: Пользователь скрыл имя, 24 Июня 2015 в 11:42, доклад
Хроматографией называется физико-химический метод разделения смесей, в котором разделяемые компоненты распределены между двумя фазами. Одна из этих фаз (стационарная фаза) неподвижна, а другая (подвижная фаза) постоянно движется в определенном направлении.
По свойствам подвижной и неподвижной фаз хроматографические методы можно разделить на следующие типы, показанные на схеме.
Неподвижная фаза (сорбент)
В качестве сорбентов обычно применяются:
5. Химически модифицированные хиральные сорбенты, например производные целлюлозы и амилозы, протеины и пептиды, циклодекстрины, используемые для разделения энантиомеров (хиральная хроматография).
Сорбенты с привитыми фазами могут иметь различную степень химической модификации. Частицы сорбента могут иметь сферическую или неправильную форму и разнообразную пористость.
В качестве привитых фаз наиболее часто применяются:
– октильные группы [Si-(CH2)7-CH3] (сорбент октилсилан или С8);
– октадецильные группы [Si-(CH2)17-CH3] (сорбент октадецилсилан (ODS) или С18);
– фенильные группы [Si-(CH2)n-(C6H5)] (сорбент фенилсилан);
– цианопропильные группы [Si-(CH2)3-CN] (сорбент CN);
– аминопропильные группы [Si-(CH2)3-NH2] (сорбент NH2);
– диольные группы [Si-(CH2)3-OCH(OH)-CH2-OH] (сорбент диол).
Наиболее часто анализ выполняют на неполярных привитых фазах в обращенно-фазовом режиме с применением сорбента С18.
В некоторых случаях более целесообразно применять нормально-фазовую хроматографию. При этом используют силикагель или полярные привитые фазы («CN», «NH2», «диол») в сочетании с неполярными растворителями.
Сорбенты с привитыми фазами химически устойчивы при значениях pH от 2,0 до 8,0, если другое специально не оговаривается производителем. Частицы сорбента могут иметь сферическую или неправильную форму и разнообразную пористость. Размер частиц сорбента в аналитической ВЭЖХ обычно составляет 3–10 мкм, в препаративной ВЭЖХ – до 50 мкм и более. Используются также монолитные сорбенты.
Высокая эффективность разделения обеспечивается высокой площадью поверхности частиц сорбента (которая является следствием их микроскопических размеров и наличия пор), а также равномерностью состава сорбента и плотной и равномерной его упаковкой.
Детекторы
Используются различные способы детектирования. В общем случае ПФ с растворенными в ней компонентами после хроматографической колонки попадает в ячейку детектора, где непрерывно измеряется то или иное ее свойство (поглощение в УФ или видимой области спектра, флуоресценция, показатель преломления, электропроводность и др.). Полученная при этом хроматограмма представляет собой график зависимости некоторого физического или физико-химического параметра ПФ от времени.
Наиболее распространенными являются спектрофотометрические детекторы (включая диодно-матричные), регистрирующие изменение оптической плотности в ультрафиолетовой, видимой и часто в ближней инфракрасной областях спектра от 190 до 800 или 900 нм. Хроматограмма в этом случае представляет собой зависимость оптической плотности ПФ от времени.
Традиционно используемый спектрофотометрический детектор позволяет проводить детектирование при любой длине волны в его рабочем диапазоне. Применяются также мультиволновые детекторы, позволяющие проводить детектирование при нескольких длинах волн одновременно.
С помощью диодно-матричного детектора можно не только проводить детектирование сразу по нескольким длинам волн, но и практически мгновенно (без сканирования) получать оптический спектр ПФ в любой момент времени, что значительно упрощает качественный анализ разделяемых компонентов.
Чувствительность флуоресцентных детекторов примерно в 1000 раз выше чувствительности спектрофотометрических. При этом используется либо собственная флуоресценция, либо флуоресценция соответствующих производных, если само определяемое вещество не флуоресцирует. Современные флуоресцентные детекторы позволяют не только получать хроматограммы, но и регистрировать спектры возбуждения и флуоресценции анализируемых соединений.
Для анализа образцов, не поглощающих в УФ и видимой областях спектра (например, углеводов), используют рефрактометрические детекторы (рефрактометры). Недостатки этих детекторов – их низкая (по сравнению со спектрофотометрическими детекторами) чувствительность и значительная температурная зависимость интенсивности сигнала (детектор необходимо термостатировать).
используются также электрохимические детекторы (кондуктометрические, амперометрические и др.), масс-спектрометрические и Фурье-ИК-детекторы, детекторы светорассеивания, радиоактивности и некоторые другие.
Подвижная фаза
В качестве ПФ могут применяться разнообразные растворители – как индивидуальные, так и их смеси.
В нормально-фазовой хроматографии обычно применяются жидкие углеводороды (гексан, циклогексан, гептан) и другие относительно неполярные растворители с небольшими добавками полярных органических соединений, которые регулируют элюирующую силу ПФ.
В обращено-фазовой хроматографии в состав ПФ входят полярные органические растворители (обычно ацетонитрил и метанол) и вода. Для оптимизации разделения часто используют водные растворы с определенным значением рН, в частности буферные растворы. Применяют добавки неорганических и органических кислот, оснований и солей и другие соединения (например, хиральные модификаторы для разделения энантиомеров на ахиральном сорбенте).
Контроль значения рН необходимо осуществлять отдельно для водного компоненента, а не для его смеси с органическим растворителем.
ПФ может состоять из одного растворителя, часто из двух, при необходимости – из трех и более. Состав ПФ указывают как объемное соотношение входящих в нее растворителей. В отдельных случаях может указываться массовое соотношение, что должно быть специально оговорено.
При использовании УФ-спектрофотометрического детектора ПФ не должна иметь выраженного поглощения при выбранной для детектирования длине волны. Предел прозрачности или оптическая плотность при определенной длине волны растворителя конкретного изготовителя часто указывается на упаковке.
На хроматографический анализ большое влияние оказывает степень чистоты ПФ, поэтому предпочтительно применять растворители, выпущенные специально для жидкостной хроматографии (включая воду).
ПФ и анализируемые растворы не должны содержать нерастворившихся частиц и пузырьков газа. Воду, полученную в лабораторных условиях, водные растворы, предварительно смешанные с водой органические растворители, а также анализируемые растворы необходимо подвергать тонкой фильтрации и дегазации. Для этих целей обычно применяют фильтрование под вакуумом через инертный по отношению к данному растворителю или раствору мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм.
Система сбора и обработки данных
Современная система обработки данных представляет собой сопряженный с хроматографом персональный компьютер с установленным программным обеспечением, позволяющим регистрировать и обрабатывать хроматограмму, а также управлять работой хроматографа и следить за основными параметрами хроматографической системы.
Перечень условий хроматографирования, подлежащих указанию
В частной фармакопейной статье должны быть приведены размеры колонки, тип сорбента с указанием размера частиц, температура колонки (если необходимо термостатирование), объем вводимой пробы (объем петли), состав ПФ и способ ее приготовления, скорость подачи ПФ, детектор и условия детектирования, описание градиентного режима (если используется), время хроматографирования.
ИОНООБМЕННАЯ И ИОННАЯ ВЭЖХ
Ионообменная хроматография используется для анализа как органических (гетероциклические основания, аминокислоты, белки и др.), так и неорганических (различные катионы и анионы) соединений. Разделение компонентов анализируемой смеси в ионообменной хроматографии основано на обратимом взаимодействии ионов анализируемых веществ с ионными группами сорбента. В качестве сорбентов используются аниониты или катиониты. Эти сорбенты представляют собой, в основном, либо полимерные ионообменные смолы (обычно сополимеры стирола и дивинилбензола с привитыми ионными группами), либо силикагели с привитыми ионообменными группами. Сорбенты с группами —(СН2)3N+Х– используются для разделения анионов, а сорбенты с группами —(СН2)SО3–Н+ – для разделения катионов. Обычно для разделения анионов применяют полимерные смолы, а для разделения катионов – модифицированные силикагели.
В качестве ПФ в ионообменной хроматографии применяют водные растворы кислот, оснований и солей. Обычно используются буферные растворы, позволяющие поддерживать определенные значения рН. Возможно также использование небольших добавок смешивающихся с водой органических растворителей – ацетонитрила, метанола, этанола, тетрагидрофурана.
Ионная хроматография — вариант ионообменной хроматографии, в котором для определения концентрации ионов анализируемого вещества используется кондуктометрический детектор. Для высокочувствительного определения изменений электропроводности проходящей через детектор ПФ фоновая электропроводность ПФ должна быть низкой.
Существуют два основных варианта ионной хроматографии.
Первый из них основан на подавлении электропроводности электролита ПФ с помощью второй ионообменной колонки, находящейся между аналитической колонкой и детектором. В этой колонке происходит нейтрализация ПФ и анализируемые соединения попадают в ячейку детектора в деионизированной воде. Детектируемые ионы являются единственными ионами, обеспечивающими проводимость ПФ. Недостаток подавляющей колонки – необходимость ее регенерации через достаточно короткие промежутки времени. Подавляющая колонка может быть заменена непрерывно действующим мембранным подавителем, в котором состав мембраны непрерывно обновляется потоком регенерирующего раствора, движущегося в направлении, противоположном направлению потока ПФ.
Второй вариант ионной хроматографии – одноколоночная ионная хроматография. В этом варианте используется ПФ с очень низкой электропроводностью. В качестве электролитов широко применяют слабые органические кислоты – бензойную, салициловую или изофталевую.
ЭКСКЛЮЗИОННАЯ ВЭЖХ
Эксклюзионная хроматография (гель-хроматография) – особый вариант ВЭЖХ, основанный на разделении молекул по их размерам. Распределение молекул между неподвижной и подвижной фазами основано на размерах молекул и частично на их форме и полярности. Для разделения используют пористые сорбенты – полимеры, силикагель, пористые стекла и полисахариды. Размер частиц сорбентов 5–10 мкм.
Преимуществами пористых стекол и силикагеля являются быстрая диффузия ПФ и молекул анализируемого вещества в поры, устойчивость в различных условиях (даже при высоких температурах). Полимерные сорбенты представляют собой сополимеры стирола и дивинилбензола (это гидрофобные сорбенты, используемые с неполярными подвижными фазами) и гидрофильные гели, получаемые из сульфированного дивинилбензола или полиакриламидных смол.
Возможны два предельных типа взаимодействия молекул с пористой неподвижной фазой. Молекулы, размер которых больше среднего диаметра пор, вообще не проникают в сорбент и элюируются вместе с подвижной фазой первыми. Молекулы с диаметром значительно меньше размера пор сорбента свободно проникают в него, остаются в неподвижной фазе наибольшее время и элюируются последними. Молекулы средних размеров проникают в поры сорбента в зависимости от размера и частично в зависимости от своей формы. Они элюируются с различными временами удерживания между самыми крупными и самыми мелкими молекулами. Разделение компонентов хроматографируемого образца происходит в результате повторяющихся актов диффузии компонентов образца в поры сорбента, и обратно.
В эксклюзионной хроматографии для характеристики удерживания используется объем удерживания, равный произведению скорости потока ПФ на время удерживания.
Подвижная фаза. Выбор ПФ зависит от типа сорбента. Эксклюзионная хроматография в целом делится на гель-фильтрационную и гель-проникающую хроматографию.
Метод гель-фильтрационной хроматографии используют для разделения водорастворимых соединений на гидрофильных сорбентах. Подвижные фазы представляют собой водные буферные растворы с заданным значением рН.
В гель-проникающей хроматографии применяются гидрофобные сорбенты и неполярные органические растворители (толуол, дихлорметан, тетрагидрофуран). Этот метод используют для анализа соединений, малорастворимых в воде.
Детекторы. В качестве детекторов в эксклюзионной хроматографии используются дифференциальные рефрактометрические детекторы, а также спектрофотометрические детекторы (в том числе, в ИК-области спектра). Применяются также вискозиметрический и проточный лазерный детекторы. Эти детекторы в комбинации с рефрактометром или другим концентрационным детектором позволяют непрерывно определять молекулярную массу полимера в ПФ.