Механизмы гибели клеток при действии оливомицина и его производных

 

 

 

 

 

 

                                                                                   На правах рукописи

 

 

Самусенко Алексей Владимирович

 

 

  Механизмы гибели клеток при действии

оливомицина и его производных

 

 

14.00.14 - онкология

 

 

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

 

 

 

Москва

2009

 

 

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук

Российском онкологическом научном центре

имени Н. Н. Блохина РАМН, Москва

 

 

Научный руководитель

доктор медицинских наук  А. А. Штиль

 

 

Официальные оппоненты:

 

доктор медицинских наук, профессор В.М. Бухман,

 

доктор медицинских наук, профессор И. В. Высоцкая.

 

Ведущее учреждение: Российский государственный медицинский университет.

 

 

 

Защита диссертации состоится ____   _________ 2009 г. на заседании специализированного Ученого Совета Д.001.017.01 при

РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.

 

 

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

 

Автореферат разослан ____   _________ 2009 г.

 

 

 

Ученый секретарь специализированного Ученого Совета

доктор медицинских наук                                                     Ю.В. Шишкин

 

 

 

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы 

Антибиотики – производные ауреоловой кислоты – оливомицин, хромомицин А3 и митрамицин – соединения с высокой биологической активностью. Особую важность представляет оливомицин – соединение, структура которого впервые описана отечественными исследователями. Клинические испытания показали, что монохимиотерапия оливомицином приводит к значительному уменьшению объема опухолей лимфоидной ткани и саркомы матки. Побочное действие препарата – общерезорбтивная токсичность – обусловливает необходимость поиска структурных аналогов этого перспективного вещества с меньшей токсичностью и выяснения молекулярных механизмов гибели клеток при действии этого класса противоопухолевых соединений.

Выявлена внутриклеточная мишень оливомицина – двухцепочечная ДНК, с малой бороздкой которой оливомицин связывается в виде димера в присутствии Mg2+, преимущественно в GC-богатые участки. Этот факт позволяет рассматривать оливомицин как агент, повреждающий структуру дуплекса. Ожидаемыми последствиями такого повреждения следует считать нарушение матричных процессов – транскрипции генов, синтеза ДНК.

          Молекулярные  механизмы клеточной гибели при  действии производных ауреоловой  кислоты не изучены. Например, клетки  могут погибать по механизму  апоптоза, сопровождающемуся активацией  каскадов каспаз, митохондриальными событиями и фрагментацией геномной ДНК. Последнее означало бы, что гибель реализуется до необратимых этапов. Это существенно, т.к. в опухолевых клетках могут быть блокированы те или иные пути гибели в результате отбора при прогрессии опухоли и лечебных воздействий.

 

Цель исследования – получение новых знаний о молекулярных механизмах гибели опухолевых клеток человека при действии оливомицина и его новых производных.

Задачи:

         1. Изучить цитотоксичность оливомицина для культивируемых клеток опухолей человека, в том числе сублиний с молекулярными детерминантами лекарственной  устойчивости.

2. Установить влияние оливомицина  на матричные процессы в бесклеточной  системе и в культуре клеток: синтез ДНК и генную транскрипцию.

3. Выявить роль “ядрышкового  стресса” в цитотоксичности оливомицина.

4. Исследовать новые производные  оливомицина, выбрать менее токсичные  и установить механизм снижения  цитотоксичности для оптимизации препаратов этого химического класса, пригодных для предклинических испытаний. 

Заключение?

Новым являются систематическое исследование молекулярных механизмов гибели клеток при действии оливомицина и его производных. Впервые исследована токсичность новых соединений для культивируемых линий опухолей молочной железы, толстой кишки, меланомы, лейкоза - клеток дикого типа и сублиний, устойчивых к ряду лекарств.

Впервые определены типы клеточной гибели, вызываемой оливомицином. Установлено, что это соединение вызывает апоптоз в низких концентрациях (в наномолярном диапазоне) в течение 24 часов воздействия. Апоптоз сопровождается межнуклеосомной деградацией ДНК.

При исследовании механизма регуляции матричного синтеза оливомицином впервые установлен эффект оливомицина на транскрипционный аппарат: транскрипцию, опосредованную РНК-полимеразами I, II и III. Впервые проведен детальный анализ нарушений экспрессии генов в ответ на действие оливомицина методом микрочип-анализа. Показано, что соединение ингибирует транскрипцию, опосредованную РНК-полимеразами I и II, но не РНК-полимеразой III.

Впервые выявлена роль нарушений структуры ядрышка  - сегрегации его компонентов - как фактора индукции клеточной гибели при действии оливомицина.

Новыми являются данные об активации оливомицином р53-зависимой транскрипции – промотор-репортерной конструкции с р53-зависимой регуляторной областью и гена р21, экспрессия которого опосредована р53.

Впервые показано, что оливомицин непосредственно ингибирует синтез ДНК. Оливомицин вызывает торможение синтеза ДНК в первые часы воздействия.

Впервые изучена серия новых производных оливомицина с модификациями отдельных химических групп в молекуле. Новые производные проявляли меньшую цитотоксичность, чем оливомицин. При этом цитотоксичность новых производных оставалась достаточно высокой (в микромолярном диапазоне концентраций). Снижение цитотоксичности нового производного обусловлено более низкой константой связывания с двухцепочечной ДНК.

 

 

Материалы и методы исследования

Клеточные линии.

Использованы линии трансформированных клеток человека: К562 (лейкоз) и вариант К562i/S9, несущий вектор, экспрессирующий Pgp; HepG2 (гепатома); А549 (рак легкого); MCF-7 (рак молочной железы) и сублиния MCF-7Dox, полученная при отборе на устойчивость к доксорубицину - противоопухолевому препарату, транспортируемому Pgp; BE(2)C (нейробластома); A2780 (рак яичника) и резистентный к цисплатину вариант A2780/DDP4; HCT116 (рак толстой кишки) и вариант HCT116WafConALacZ c интегрированной в геном конструкцией, включающей участок промотора гена р21 c р53-зависимыми регуляторными элементами и ген-репортер (b-галактозидаза). Клетки культивировали в среде RPMI-1640 или ее модификациях с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки, 2мM L-глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина при 370С, 5% CO2. В экспериментах использовались клетки в логарифмической фазе роста. Реактивы приобретены в фирме “Sigma” (США) кроме особо оговоренных случаев. Оливомицин и его производные получены в НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе РАМН (Tevyashova et al., 2009). Структура соединений подтверждена данными 1Н- и 13С-ЯМР спектроскопии. Соединения растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) и хранили при 40С.

Определение цитотоксичности соединений.

       Диапазон цитотоксических  концентраций различных веществ  оценивали по способности клеток восстанавливать бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия в формазан (МТТ-тест). Клетки в 96-луночных планшетах (5х104 клеток на лунку) инкубировали с исследуемым препаратом в различных концентрациях 24-72 ч. при 370С, 5%СО2. После окончания инкубации в лунки вносили 100 мкг МТТ на 2 ч., растворяли формазан в ДМСО и измеряли оптическую плотность при длине волны возбуждения 540 нм. Цитотоксичность выражали в процентах оптической плотности формазана, образованного клетками, инкубированными с исследуемым препаратом, к оптической плотности формазана в контрольных лунках (Shchekotikhin et al., 2007).

Межнуклеосомная деградация ДНК.

Для изучения межнуклеосомной деградации ДНК клетки (2х106), инкубированные с 100 нМ оливомицина 24-72 ч., осаждали при 1000×g, надосадочную жидкость центрифугировали при 12000×g в течение 15-20 минут, осадки объединяли и лизировали в буфере, содержащем 20 мМ Tris-HCl, рН 7,4, 0,35М  NaCl, 0,5% NP-40, 2 мМ MgCl2, 1мМ дитиотрейтола. ДНК экстрагировали смесью фенола и хлороформа (1:1) и осаждали этанолом в присутствии 0,3 М ацетата натрия при –200С. Осадок обрабатывали РНК-азой А 20 мин. при 650C и анализировали в электрофорезе в 1,5% агарозном геле.

Исследование клеточного цикла.

Клетки обрабатывали оливомицином или оставляли необработанными (контроль), после окончания инкубации осаждали центрифугированием. К осадку клеток добавляли 0,4 мл буфера, содержащего 0,1% цитрата натрия, 0,3% детергента NP-40, 100 мкг/мл РНКазы А и 50 мкг/мл пропидия иодида и перемешивали на vortex. Исследовали флуоресценцию на проточном цитофлуориметре по FL2, накапливая 10000 событий для каждого образца.

          Изучение р53-зависимой активации транскрипции.

Клетки HCT116WafConALacZ обрабатывали 24 ч. митоксантроном (0,5 мкM) или 5-фторурацилом (3 мкM). В опытах по ингибированию транскрипции одновременно с этими препаратами добавляли 100 нМ оливомицина или 5 мкM оливина. После инкубации клетки лизировали в буфере, содержащем 1мM MgCl2, 250 мM Tris-HCl, pH 7,4, 0,02% NP-40 и 0,2% о-нитрофенил-b-D-галактопиранозид (субстрат b-галактозидазы) и инкубировали при 370С 30 мин. Активность b-галактозидазы (по оптической плотности лизатов, l=414 нм) относили к общей концентрации белка в лизатах (удельная активность). Регуляцию транскрипции (индекс активации) выражали как отношение удельной активности b-галактозидазы в клетках, обработанных противоопухолевыми препаратами, к удельной активности фермента в необработанных клетках. Для статистической обработки данных использовали t-критерий Стъюдента (Kaluzhny et al., 2009).

Электронная микроскопия.

Клетки НСТ116 рассевали на предметные стекла, обрабатывали оливомицином и фиксировали глутаровым альдегидом. Трансмиссивную электронную микроскопию выполняли в отделе патологической анатомии опухолей человека РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН (Н.А.Филиппова) на микроскопе JEM-1200 EX-II (Япония). 

           Исследование экспрессии генов.

Клетки инкубировали с оливомицином в 6-луночных планшетах (105 на лунку в 3 мл). Тотальную РНК выделяли с помощью TRIzol. Обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию проводили по ранее разработанному протоколу (Walter et al., 1996). Праймеры для анализа экспрессии гена р21: 5’-GGAAGACCATGTGGACCTGT-3’ (прямой) и 5’-ATGCCCAGCACTCTTAGGAA-3’ (обратный). Праймеры для амплификации кДНК бета-актина: 5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’ (прямой) и 5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’ (обратный) (Шишкин и соавт., 2005). Продукты реакции анализировали в 1% агарозном геле, окрашивали бромистым этидием и анализировали с помощью Gel Documentation System.

Исследование репликации ДНК.

Клетки К562 в 96-луночных планшетах инкубировали с оливомицином или его производным ЛХТА-1207 2 часа, добавляли 1 мкКи 3Н-тимидина и инкубировали 2 часа. Затем клетки лизировали водой, переносили на целлюлозную мембрану, просушивали и переносили во флаконы, содержащие сцинтилляционную жидкость. Измеряли количество импульсов в минуту на счетчике фирмы Beckman.

Расчет константы связывания исследуемых веществ с ДНК.

Константу связывания с ДНК определяли по Скэтчарду как изменение интенсивности флуоресценции оливомицина или производного ЛХТА-1297при добавлении ДНК:  θ/[ДНК] = 1/Ka-θ/Ka; [ДНК]своб.=[ДНК]t-[ДНК]b=[БСА]t-[вещество]t*(I-Io)/(Imax-Io); [вещество] своб =[ вещество t*(Imax-I)/(Imax-Io); [вещество] связ. =[вещество]t*(I-Io)/(Imax-Io); θ=[ вещество] связ./[вещество]t=[ДНК] связ./[вещество]t. В данных уравнениях Ka – константа связывания, Io , Imax , I – значения интенсивности флуоресценции, минимальной, максимальной и текущей соответственно, [вещество] и [DNA] – концентрации ииседуемого вещества и ДНК, индексы связ. и своб.  - концентрации соединения, связанного с ДНК и свободного (Ol’shevskaya et al., 2008).

Результаты исследования

Структура оливомицина представлена на рис.1. 

                

Рис.1. Структура оливомицина. 

 

При исследовании цитотоксичности установлено, что оливомицин вызывает гибель клеток лейкоза человека (линия К562) в наномолярных концентрациях: доза, снижающая выживание на 50% (IC50), составляет ~ 30 нМ. В этом же диапазоне концентраций (IC50=20-50 нМ) оливомицин вызывал гибель клеток линий HepG2, А2780, A549, MCF-7, BE(2)C и HCT116.  Цитотоксичность оливомицина была одинаковой для клеток HCT116, экспрессирующих проапоптотический белок р53, и сублинии с делецией р53. Далее, оливомицин вызывал гибель клеток A2780 (линия дикого типа) и A2780/DDP4, причем цитотоксическое действие оливомицина было даже более выраженным в клетках, устойчивых к цисплатину: IC50 оливомицина для клеток А2780 оказалась в интервале 25-50 нМ, тогда как для А2780/DDP4 – 12,5-25 нМ. Таким образом, развитие устойчивости клеток к цисплатину не сопровождается снижением чувствительности к оливомицину. Не выявлено различий в чувствительности к оливомицину клеток меланомы FEMX и изогенной сублинии, устойчивой к ростингибирующему действию дексаметазона. Эти результаты указывают на широту терапевтического диапазона оливомицина.

Изучение механизмов гибели клеток при действии оливомицина свидетельствует о том, что препарат индуцирует апоптоз. Уже в первые часы воздействия оливомицин вызывал изменения, характерные для апоптоза: краевую конденсацию хроматина и нарушение целостности ядра (рис.2 А,Б).