Механизмы гибели клеток при действии оливомицина и его производных

 Рис. 2. Ультраструктура клеток НС1116 после действия оливомицина (100 нМ, 4 ч).

А: краевая конденсация хроматина. Первоначальное увеличение ×4000; Б – распад ядерного материала на крупные фрагменты. Первоначальное увеличение ×20000.

Более продолжительная (24-48 час.) обработка клеток приводила к межнуклеосомной фрагментации ДНК (рис. 3). К 48 час. воздействия наряду с низкомолекулярными фрагментами наблюдается и деградация высокомолекулярного пула молекул ДНК. Таким образом, гибель клеток при действии оливомицина сопровождается выраженным нарушением целостности ДНК.  

       0              24          48  час.         

Рис. 3. Фрагментация ДНК при действии оливомицина.

Клетки линии НСТ116 инкубированы с 200 нМ оливомицина 24-48 час.  Анализ целостности ДНК (электрофорез в 1% агарозном геле).

 

Деградация ДНК подтверждена в исследовании плоидности ДНК в клетках, обработанных оливомицином: суб-G1 пик гистограммы (соответствующий фрагментированной ДНК) обнаруживали через 24-48 час. инкубации с 50-500 нМ оливомицина.

Исследование взаимодействия оливомицина с внутриклеточной мишенью – двухцепочечной ДНК показало, что в присутствии ДНК  увеличивается интенсивность полос (λ=534 нм и λ=450 нм) в спектре флуоресценции оливомицина, свидетельствуя об образовании комплекса ДНК-оливомицин (рис.4.)

Рис.4. Спектры флуоресценции оливомицина (8.35·10-7 M) в 10 мM Tris-HCl буфере (pH 7,5), 50 мкM MgCl2.

Константу комплексообразования определяли по методу Скэтчарда, измеряя интенсивность флуоресценции (при λ=534 нм) при добавлении возрастающих количеств ДНК в раствор оливомицина (рис. 5).

Рис. 5. График Скэтчарда для комплексов оливомицина и ДНК.

Вычисленная константа связывания Ka=3.66х104 M-1.

Следствием образования комплексов оливомицин-ДНК, важным для установления механизма противоопухолевого действия этого соединения, может являться ингибирование матричных процессов – транскрипции и репликации ДНК. Изучены эффекты оливомицина на транскрипцию, опосредованную РНК-полимеразами I, II и III. При инкубации клеток  MCF-7 в присутствии 12.5 нМ оливомицина на электронных микрофотографиях видна сегрегация ядрышек, проявляющаяся в перераспределении гранулярного и фибриллярного компонентов (рис.6). Этот феномен  - признак ингибирования РНК-полимеразы I.

А   Б

Рис. 6. Сегрегация ядрышек при действии оливомицина.

Клетки рака молочной железы MCF-7 обработаны 12,5 нМ оливомицина 3 часа и фиксированы для электронной микроскопии. Видно перераспределение компонентов ядрышек (сегрегация).

 

Для изучения влияния оливомицина на РНК-полимеразу II вначале исследовано действие соединения на р53-зависимую транскрипцию. Для индукции р53 использованы противоопухолевые препараты митоксантрон и 5-фторурацил (5-ФУ). Блокирующее действие оливомицина на р53-зависимую транскрипцию возрастало с увеличением его концентрации и проявлялось уже при 25 нМ. Оливомицин (100 нМ) полностью отменял активируемую 5-ФУ (колонки 3 и 4; p<0.05) или митоксантроном (колонки 5 и 6; p<0.05) транскрипцию β-галактозидазы (рис.7). Важно, что оливомицин предотвращал не только индуцибельную (вызванную воздействием индукторов р53) транскрипцию, но и базальную активность промотора (колонки 1 и 2; p<0.05). 

Рис. 7. Изменение р53-зависимой транскрипции под действием оливомицина.

1 – необработанные клетки HCT116WafConALacZ, 2 – оливомицин, 3 – 5-ФУ, 4 – 5-ФУ+оливомицин, 5 – митоксантрон,

6 – митоксантрон + оливомицин. Данные 5 независимых экспериментов.

В соответствии с результатами экспериментов в модельной системе – линии клеток со стабильно трансфецированной промотор-репортерной конструкцией, оливомицин подавлял базальную и активированную противоопухолевыми препаратами экспрессию эндогенного гена р21, регулируемого посредством р53 (рис. 8).

Рис. 8. Оливомицин ингибирует экспрессию гена p21.

Клетки линии НСТ116 обработаны согласно указанным подписям. Выделена РНК, проведена обратная транскрипция и ПЦР. Представлен электрофорез продуктов ПЦР в 1% агарозном геле. Для изучения активированной транскрипции клетки обрабатывали 0,5 мкМ митоксантрона (митокс.) и 10 мкМ этопозида (этоп.). Концентрация оливомицина 0,5 мкМ. Бета-2-микроглобулин использован в качестве внутреннего контроля ПЦР.

 

           Для  выяснения способности оливомицина  препятствовать синтезу второй  цепи ДНК в бесклеточной системе, мы применили собственный вариант polymerase stop assay. Оливомицин вносили в реакционные смеси в увеличивающихся количествах и проводили ПЦР с праймерами, амплифицирующими кДНК бета-актина. Контролем служили образцы ПЦР в отсутствие оливомицина. Обнаружена зависимость количества продукта амплификации от концентрации антибиотика в реакционной смеси (рис. 9).

 

Рис. 9. Влияние оливомицина на синтез второй цепи ДНК.

В реакционную смесь добавляли оливомицин в конечных концентрациях 0,1, 1, 10, 100 µМ. В контрольные пробы добавляли эквивалентное количество ДМСО. Проводили ПЦР, используя кДНК бета-актина в качестве матрицы. Представлена фотография электрофореза продуктов ПЦР в 1% агарозном геле. К- ПЦР в отсутствие матрицы.

 

Для детализации механизмов влияния оливомицина на функции клеток, важные для выживания, проведен микрочип-анализ транскрипции 18 000 генов человека. Для анализа использовалась тотальная РНК клеток линии рака толстой кишки HCT116, инкубированных с 0,5 нМ оливомицина 4-24 час. Оливомицин оказывал значительное ингибирующее действие на ~30% исследованных генов (диапазон ингибирования 2-60 раз). В то же время оливомицин активировал транскрипцию ~40% генов, например, гена каспазы-1 (63-кратная активация) и цитохрома с (27-кратная активация). Таким образом, оливомицин вызывает выраженное влияние на транскрипцию, опосредованную РНК-полимеразой II. Это влияние не сводится к ингибированию; антибиотик вызывает дисбаланс в транскрипционной активности клетки.

При изучении действия оливомицина на транскрипцию, опосредованную РНК-полимеразой III (в ПЦР с праймерами, амплифицирующими гены 7SL, tРНК-Tyr и 5S-РНК, транскрибируемые этой полимеразой II), мы не получили значимых изменений транскрипции этих продуктов. Таким образом, влияние оливомицина на генную транскрипцию разнонаправленно. Если оливомицин блокирует транскрипцию, опосредованную РНК-полимеразой I в наномолярных концентрациях в первые минуты воздействия, то действие соединения на транскрипцию, опосредованную РНК-полимеразой II, разнонаправленно и заключается в подавлении экспрессии одних генов и активации других. На транскрипцию, опосредованную РНК-полимеразой III, оливомицин действия не оказывает.

Комплексообразование с ДНК позволяет предположить, что оливомицин препятствует репликации ДНК. Действительно, эксперименты по включению радиоактивного тимидина в клетки линии НСТ116 свидетельствуют о способности оливомицина подавлять синтез ДНК в логарифмически растущей культуре (рис.10). В качестве положительного контроля ингибирования включения 3Н-тимидина использован афидиколин – блокатор ДНК-полимеразы. Оливомицин (500 нМ, 2 часа) резко снижал синтез ДНК, и этот эффект сохраняется на протяжении последующих часов. Совпадение диапазона концентраций, при которых оливомицин ингибирует синтез ДНК, и концентраций, вызывающих гибель клеток, позволяет утверждать, что одним из механизмов цитотоксичности оливомицина является ингибирование репликации.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 10. Влияние оливомицина на репликацию (по включению Н3-тимидина).

Клетки НСТ116 обрабатывали указанными концентрациями оливомицина 2 часа, затем вносили 1 мкКи Н3-тимидина и продолжали инкубацию 2 часа.  О репликации судили по включению радиоактивной метки. Афид, афидиколин, олив. – оливомицин. Представлены данные 3-х экспериментов.

 

Таким образом, оливомицин обладает важными свойствами: 1) вызывает апоптоз опухолевых клеток человека различной тканевой принадлежности, 2) токсичен для клеток, экспрессирующих механизмы устойчивости к ряду ксенобиотиков, 3) подавляет генную транскрипцию 4) подавляет репликацию ДНК. О высокой противоопухолевой активности препарата свидетельствует то, что оливомицин вызывает указанные эффекты в наномолярных концентрациях в течение относительно кратковременной обработки. Поскольку цитотоксичность, антитранскрипционное и антирепликативное действие оливомицина проявляются в одном и том же диапазоне концентраций, гибель клеток при действии препарата связана с его способностью ингибировать транскрипцию и синтез ДНК.

Для подавления генной транскрипции и репликации, приводящей к индукции клеточной гибели, требуется высокая аффинность взаимодействия оливомицина с ДНК. Следовательно, производные оливомицина с меньшей константой комплексообразования с дуплексом будут менее токсичны. При этом необходимо выбрать производные с приемлемой противоопухолевой активностью для культивируемых опухолевых клеток. В НИИ по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф.Гаузе РАМН синтезирован ряд производных оливомицина. На культуре клеток HCT116 изучена способность новых производных вызывать гибель клеток в течение 72 час. воздействия (МТТ-тест). Оказалось, что все новые производные менее токсичны, чем оливомицин. Для детального исследования выбрано соединение ЛХТА-1297 (рис. 11) – производное с объемным адамантильным заместителем в боковой цепи агликона. Опираясь на методы определения противоопухолевых свойств, использованные в экспериментах с оливомицином, мы исследовали способность ЛХТА-1297 связываться с двухцепочечной ДНК, влиять на синтез второй цепи ДНК in vitro и репликацию в логарифмически растущей культуре.

 

                       

Рис. 11. Структура ЛХТА-1297.

Цитотоксичность (IC50) ЛХТА-1297 для клеток НСТ116 составила в среднем 110 нМ, что приемлемо для противоопухолевого препарата, поскольку соединение активно в субмикромолярных концентрациях. Константу связывания ЛХТА-1297 с ДНК определяли по изменению интенсивности флуоресценции (λ=520 нм) при добавлении ДНК (рис. 12).

Рис. 12. График Скэтчарда для взаимодействия ЛХТА-1297 и ДНК.

Ka1=2.94х103 M-1; Ka2=1.32х104 M-1.

 

Из рис.12 следует, что константы связывания ЛХТА-1297 с ДНК меньше, константа связывания оливомицина. Это позволило предположить, что влияние ЛХТА-1297 на матричные процессы менее выражено, чем у оливомицина. При проведении ПЦР с праймерами, фланкирующими кДНК бета-актина, в присутствии ЛХТА-1297 видно, что данное производное не препятствует реакции даже в высоких концентрациях (рис. 13). ЛХТА-1297 не влиял на включение клетками 3Н-тимидина в концентрациях до 2,4 мкМ, тогда как оливомицин подавлял репликацию уже в субмикромолярных концентрациях (рис.14). Таким образом, ЛХТА-1297 оказался менее активным, чем оливомицин, и как цитотоксический агент, и как ингибитор синтеза ДНК in vitro и в живых клетках. Ослабление этих свойств у ЛХТА-1297 можно объяснить меньшей константой связывания с ДНК в сравнении с оливомицином.

Рис. 13. Сравнение влияния ЛХТА-1297 и оливомицина на синтез второй цепи ДНК.

В реакционную смесь добавляли ЛХТА-1297 или оливомицин. Проводили ПЦР, используя кДНК бета-актина в качестве матрицы. Представлен электрофорез продуктов ПЦР в 1% агарозном геле. Дорожки: 1-маркер молекулярных масс ДНК; 2-ДМСО; 3,4,5,6-оливомицин 1, 10, 50, 100 мМ соответственно; 7,8,9,10  - ЛХТА-1297 в концентрациях 1, 10, 50 и 100 мМ соответственно.

 

Рис. 14. Сравнение влияния ЛХТА-1297 и оливомицина на репликацию ДНК (по включению 3Н-тимидина).

Клетки НСТ116 обрабатывали оливомицином или ЛХТА-1297 2 часа, затем вносили 1 мкКи 3Н-тимидина и продолжали инкубацию 2 часа. Представлены данные 3-х экспериментов.

                                                                 

 

 

 

Выводы 
1. Оливомицин - высокоактивный противоопухолевый антибиотик: гибель культивируемых клеток опухолей человека наступает при действии субмикромолярных концентраций соединения. Оливомицин одинаково токсичен для клеток дикого типа и сублиний, устойчивых к действию дексаметазона и цисплатина. Оливомицин не преодолевает множественную лекарственную устойчивость, опосредованную Р-гликопротеином, тогда как делеция р53 не защищает клетки от токсичности оливомицина. 
2. Молекулярный механизм гибели клеток при действии оливомицина – апоптоз, сопровождающийся межнуклеосомной деградацией ДНК.  
3.Апоптоз при действии оливомицина вызывается образованием высокоаффинных комплексов соединения с двухцепочечной ДНК, трансактивацией р53-зависимых генов, ингибированием синтеза ДНК и нарушениями транскрипции, опосредованной РНК-полимеразами I и II.  
4. Антитранскрипционное действие оливомицина выражается в индукции сегрегации ядрышка и подавлении экспрессии десятков генов.  
5. Новые производные оливомицина являются менее аффинными ДНК-лигандами, менее токсичны и значительно слабее ингибируют матричные синтезы в бесклеточной системе и в культуре клеток. Достаточна высокая цитотоксичность новых производных  - в микромолярных концентрациях – позволяет утверждать, что модификации химической структуры оливомицина позволят оптимизировать соединения и получить производные, обладающие противоопухолевой активностью при меньшей общерезорбтивной токсичности.

Публикации по теме диссертации

1. Симонова  В.С., Самусенко А.В., Полосухина Е.Р., Барышников А.Ю., Штиль А.А. Внутриклеточная  концентрация ксенобиотика как ключевой фактор цитотоксичности:  роль Р-гликопротеина. // Доклады Российской Академии наук. – 2004. – Т. 394. – С. 90-93.

2. Tevyashova A.N., Shtil A.A., Olsufyeva E.N., Simonova V.S., Samusenko A.V., Preobrazhenskaya M.N. Carminomycin, 14-hydroxycarminomycin and its novel carbohydrate derivatives potently kill human tumor cells and their multidrug resistant variants. //Journal of Antibiotics. – 2004. – Vol. 57. – Р. 143-150.

3. Симонова В.С., Самусенко А.В., Филиппова  Н.А., Тевяшова А.Н., Лынив Л.С., Кулик  Г.И., Чехун В.Ф., Штиль А.А. Оливомицин вызывает апоптоз опухолевых клеток и подавляет р53-индуцированную транскрипцию. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2005. – Т. 139. – С. 455-459.

4. Самусенко А.С. Нарушения клеточного  цикла и старение клеток в  ответ на повреждение ДНК. //Вопросы онкологии. – 2009. – Т. 5.- в печати.

5. Shtil A.A. , Zatsepina O.V., Grigorian I.A., Komarov P.G., Samusenko A.V., Simonova V.S., Shishkin A.A., Strom E.N., Azare J., Filippova N.A.. Olivomycin, a DNA binding anticancer agent, is a potent genome-wide transcriptional inhibitor.   In: Abstracts of 3d International symposium of targeted anticancer therapies TAT-2005, Amsterdam, the Netherlands. - 2005. – Р. 84.

6. Самусенко А.В., Штиль А.А. ДНК-связывающий антибиотик оливомицин ингибирует транскрипцию и вызывает апоптоз опухолевых клеток. Материалы конференции “Фундаментальная онкология. 2-е Чтения им.проф. Н.Н.Петрова”. Санкт-Петербург, 2006. Вопросы онкологии. – 2006. – Т. 52. - С. 30-31.

7. Shtil A.A., Dezhenkova L.G., Samusenko A.V. , Filippova N.A., Tevyashova A.N., Olsufyeva E.N., Preobrazhenskaya M.N. Olivomycin A induces multiple mechanisms of tumor cell death. In: Abstracts of International meeting ‘Cancer therapeutics: the road ahead’. Capri. Italy. – 2007. - Р. 27.