Атф индуцированное изменение внутриклеточной концентрации кальция в нейронах неокортекса крыс

 

АТФ (см. рис.1) представляет собой нуклеотид и как всякий нуклеотид состоит из трех компонентов: азотистого основания, сахара пентозы и фосфата. В качестве азотистого основания в нуклеотидах присутствуют производные пурина и пиримидина. Фосфаты соединены в полифосфатную цепь, количество которых в естественных нуклеотидах не превышает трех. Однако синтезированы нуклеотиды, содержащие линейные цепи из более чем 3-х фосфатов, к примеру аденозинтетра- и аденозинпентафосфаты.

Названия нуклеотидов, содержащих в качестве сахара рибозу, складываются из названия соответствующего нуклеозида, приставки, обозначающей количество фосфатных групп в нуклеотиде и слова фосфат. Для наиболее распространенных нуклеотидов приняты сокращенные названия, например АТФ для аденозинтрифосфата, ГТФ - для гуанозинтрифосфата, ИМФ - инозинмонофосфата.

В области нейтральных значений pH нуклеиновые основания и рибоза в растворе не заряжены (Мартин, Мариам, 1982). Нуклеотиды, из-за наличия фосфатов, представляют собой сильные кислоты. АТФ содержит четыре ОН группы, способные к ионизации, три из которых имеют pKa ниже 3, а pKa четвертой - 6,5 (Ленинджер, 1976). Таким образом, при pH 7,4 подавляющее большинство молекул АТФ представляют собой четырехзарядные анионы АТФ4- , кроме того, в растворе присутствует небольшое количество АТФ3-.

 

2. Номенклатура и субклассификация пуринорецепторов.

Первое разделение пуринорецепторов на Р1 и Р2 типы основывалось на следующем критерии: нуклеозиды такие как аденозин активировали Р1 пуринорецепторы, в то время как АТФ стимулировала Р2 пуринорецепторы, а метилксантины (кофеин, теофиллин) являются селективными антагонистами Р1 пуринорецепторов. Также Р1 пуринорецепторы связаны с аденилатциклазой, а активация Р2 пуринорецепторов может приводить к выработке простогландинов (Burnstock 1978).

3. Р1 пуринорецепторы.

В 1979 году (Van Calker et al 1979) показали, что аденозиновые, Ð1 - пуринорецепторы можно подразделить на две группы. Рецепторы одной из них обладали очень высоким сродством к аденозину (константа диссоциации Кd = 3 - 10 нМ). При взаимодействии аденозина с этой группой рецепторов наблюдалось ингибирование аденилатциклазы и, следовательно, уменьшался уровень внутриклеточного цАМФ. Этот класс рецепторов был назван А1 -рецепторами (Ri рецепторы по (Londos et al 1980)). Аденозиновые рецепторы, относящиеся ко второй группе, имели более низкое сродство к аденозину (Кd комплекса аденозина с рецептором 5-10 мкМ). Активация этого типа рецепторов приводила к стимуляции аценилатциклазы. Эти рецепторы Ван Колкер назвал А2-рецепторами (Ra рецепторы по (Londos et al 1980)). Были обнаружены также и мощные антагонисты для А1 - R-N6-Фенилизопропиладенозин (R-PIA). Для А2 более сильным антагонистом был 5’-N-этилкарбоксамидаденозин (NЕСА). Также существуют работы, в которых описываются аденозиновые рецепторы, не связанные с аденилатциклазой эти пуринорецепторы было предложено назвать А3 (Ribeiro and Sebastiao 1986). Предпосылкой к разделению А2 пуринорецепторов на А2а и А2b подтипы стало открытие разного сродства NECA к Р1 пуринорецептору, - высокого в стриатуме (А2а) и низкого в фибробластах (А2b) (Bruns et al 1986).

4. Р2 пуринорецепторы

Накопленные фармакологические доказательства, как-то: тип ответа, порядок активности агонистов, десенситизация, вызываемая АТФ и ее структурными аналогами, послужили основой для первого субделения Р2 пуринорецепторов. В 1985 году Бернсток и Кеннеди (10) указали на неоднородность популяции Р2-пуринорецепторов. Этот вывод был сделан исходя из того, что в некоторых тканях (например продольная мышца слепой кишки) АТФ вызывал расслабление гладких мышц, а в других (мышечная стенка мочевого пузыря) - сокращение. Первый подтип рецепторов был обозначен как Р2у, а второй - Р2х. Для Р2х пуринорецепторов наиболее активным агонистом был a, b - метилен АТФ (a,b-мАТФ), а для Р2у - 2 - метилтио АТФ (2-МеSАТP). Так как порядок активности лигандов может зависеть от скорости их гидролиза до неактивных соединений, которая может значительно различаться в зависимости от ткани, более четким доказательством для подразделения Р2 - рецепторов на подтипы служит наличие селективных блокаторов. Сейчас известны селективные антагонисты как для Р2х, так и Р2у-рецепторов для Р2х - a,b-мАТФ (десенситизирующее действие), арилазидаминопропионил АТФ (АНАПП3), пиридоксалфосфат-6-азофенил-2’,4’-дисульфидная кислота (PPADS), сурамин и другие; для Р2у пуринорецепторов - реактив голубой 2, сурамин. В 1986 году Гордон (23) предложил выделить из класса Р2 пуринорецепторов еще два подтипа Р2t и Р2z. Первый рецептор располагается в тромбоцитах и управляет их агрегацией. Он, в отличие от всех остальных подтипов P2 - рецепторов, активируется АДФ, и блокируется АТФ. Р2z рецепторы расположены в тучных клетках. В них АТФ в очень больших концентрациях (> 100 мкМ), а точнее четырехзарядный анион АТФ4-, вызывал кальцийзависимую секрецию гистамина. Другие пуриновые нуклеотиды, включая негидролизуемые аналоги АТФ, не активировали рецептор. Также был обнаружен неселективный антагонист данного типа рецепторов DIDS - аналог PPADS (Soltoff et al 1993). В 1991 году O’Connor предложил так называемый нуклеотидный рецептор одинаково чувствительный как к АТФ, так и к УТФ, но не чувствительный к 2 - MeSATP. Этот рецептор получил обозначение Р2u. Возможным антагонистом данного рецептора является сурамин. Также было обнаружено, что аденин динуклеотид полифосфаты также присутствуют в фармакологической периферии (Hoyle 1990). Hildermann (1991) индентифицировал сайт связывания для диаденозин тетрафосфата ( Ap4A) в мозге крысы, который получил название дипуринергического рецептора, а позднее Р2d (Pintor et al 1993). Антагонисты данного вида пуринорецепторов пока не обнаружены.

пуринорецепторы

Р1 - пуринорецепторы

Р2 - пуринорецепторы

A1

A2a

A2b

A3

P2x

P2y

P2t

P2z

P2u

P2d

Таблица 1. Классическая схема субклассификации пурино-рецепторов.

5. Реклассификация пуринорецепторов.

Из - за всевозрастающих трудностей и несогласований в классической схеме классификации Ð2 пуринорецепторов и увеличивающемся числе подтипов рецепторов, стало очевидным, что классическая схема требует пересмотра. В 1994 году Abbracchio and Burnstock предложили новую схему классификации Р2 - пуринорецепторов. Из всех Р2 - пуринорецепторов они вычленили три основных семейства: Р2Х семейство, связанное с ионотропными каналами, которое включало четыре подтипа; Р2У - связанное с активацией G - белков, включающее семь подтипов и семейство Р2Z - семейство неселективных пор. Их гипотеза основывалась в основном на изучении литературных источников и анализе фармакологического профиля новообнаруженныж агонистов. В дальнейшем теория подтвердилась клонированием различных подтипов Р2 - пуринорецепторов. В настоящее время семейство Р2Х насчитывает шесть, а Р2У - семь подклассов. Благодаря интенсивным исследованиям, практически не остается сомнений в том, что данные семейства будут расти и дальше (Collo et al 1996).

 

Р2 - пуринорецепторы

P2Z - неселективные поры

Р2Х - семейство ионотропных рецепторов

Р2У - семейство метаботропных рецепторов

Р2Х1

Р2Х2

Р2Х3

Р2Х4

Р2Х5

Р2Х6

Р2У1

Р2У2

Р2У3

Р2У4

Р2У5

Р2У6

Р2У7

Таблица 2. Современная классификация Р2 типа пуринорецепторов.

 

3. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Подготовка препарата

Исследования проводились на пирамидальных нейронах моторной области новой коры в тонких срезах мозга, выделенного из 14 дневных крыс. После декапитации мозг помещался в холодный солевой раствор (0 - 40С). Процедура от начала декапитации до выделения мозга длилась не более 60-90 секунд. Затем мозг закреплялся полиакриламидным клеем на подложке вибротома (Campden, Campden Instruments LTD, U.K.); камера вибротома заливалась холодным солевым раствором. Срезы нарезались сагитально толщиной 250 - 300 мкм; скорость подачи лезвия - 1 см/с с частотой 10 Гц. После приготовления срезы помещались в раствор постоянно насыщаемый карбогеном (5% СО2 + 95% О2). Перед загрузкой флуоресцентным красителем срезы инкубировались в постоянно оксигенируемом растворе 30 минут при температуре 32 градуса. Окраска среза осуществлялась в течении 30 - 35 минут в СО2 насыщенном термостате при температуре 35 градусов. После окраски срезы отмывались 1 - 1,5 часа в постоянно оксигенируемом растворе при комнатной температуре. Все эксперименты проводились при температуре 32 градуса.

2. Характеристики кальциевого зонда

Для количественного определения концентрации кальция в пирамидальных нейронах моторной области новой коры использовался краситель Фура-2 AM (рисунок 2) (16).

На рисунке 3 представлен спектр зонда Фура -2 AM. При связывании с кальцием происходит характерное изменение спектра возбуждения этого красителя: при возбуждении светом с длиной волны 390 нм происходит уменьшение флуоресценции, а при возбуждении светом, с длиной волны 340 нм - увеличение. Однако, 340 нм является уже ультрафиолетовым светом, и для ее использования необходим микроскоп с кварцевыми линзами. Поскольку в нашем случае был использован обычный микроскоп, то вторая волна была выбрана длиной 390 нм. 360 нм - это изобестическая точка зонда Фура -2, т.е. флуоресцентный сигнал при возбуждении светом этой длины волны не зависит от концентрации Ca2+ и есть функция лишь концентрации зонда.

Измерение флуоресценции при возбуждении двумя длинами волн позволяет легко рассчитать [Ca2+]i в клетке по формуле (24):

[Ca2+]i= Kd * b * (R - Rmin)/(Rmax-R)

где Кd - константа диссоциации комплекса Фура -2 с кальцием, R=F360/F390 - текущее отношение флуоресцентных сигналов, Rmin = F360/F390|Ca0 - то же отношение в растворе с низкой концентрацией Ca2+, Rmax = F360/F390|CaҐ¥ - то же отношение в растворе с высокой концентрацией Ca2+, b = F390|Ca0/F390|CaҐ¥ - отношение флуоресцентных сигналов в низкой и высокой концентрации Ca2+ при возбуждении длиной волны 390 нм. Параметры Rmin, Rmax и b определяли экспериментально. Для этого были приготовлены базовый раствор (в ммоль/л) : KCl - 100, Tris-Cl - 10 (pH=7.2), Фура -2 - 0.005; раствор с низкой концентрацией Ca2+ готовился без добавления Ca2+ с добавкой EGTA - 10; раствор с высокой концентрацией Ca2+ - с добавкой CaСl2 - 10. Отношение величин флуоресценции определялось в каплях приведенных выше растворов, помещенных на дно экспериментальной камеры. В результате для нашей системы Rmin= 0.33, Rmax= 8.9 и b=12.8. Параметр Кd был взял из работы [Grinkiewicz et al, 1985] и равнялся 224 нмоль/л.

3. Окраска срезов флуоресцентным красителем

Для введения кальций - чувствительного зонда в клетку, срезы инкубировались в растворе Тироде, содержащим эстерифицированную незаряженную форму красителя Фура-2 ацетоксиметилэстер в концентрации 5 мкмоль/л, растворенную в диметилсульфоксиде с добавлением детергента Плуроник F-127 (0.02%). В такой форме краситель проникает в клетку, затем эндогенными эстеразами эфирные группы отщепляются, зонд становится заряженным и покинуть клетку не может. Окраска производилась 20 минут при температуре 35оС. Концентрация зонда в клетке определялась путем титрования окрашенных клеток раствором красителя, который добавлялся во внеклеточный раствор. Оцененная таким способом концентрация зонда в клетке была в диапазоне 30 - 70 мкмоль/л.

4. Структура экспериментальной установки для двух-волнового измерения концентрации кальция

Принципиальная схема установки представлена на рисунке 4. Основными элементами ее являются: источник света, система смены фильтров, микроскоп, ФЭУ, модуль предварительной обработки сигнала и компьютер.

Источником возбуждающего света служит ртутная лампа мощностью 50 ватт. Поскольку в качестве кальций - чувствительного зонда использовали индикатор Фура -2 АМ, являющийся по возбуждению двухволновым (см. выше), то для количественного определения [Ca2+]i необходимо было одновременно индуцировать флуоресценцию обеими длинами волн. В нашей конфигурации периодическая смена фильтров возбуждения была реализована при помощи вращения колеса с вмонтированными в него двумя интерференционными фильтрами 360 и 390 нм. Частота вращения была 5 Гц. Управление системой смены фильтров осуществлялось при помощи кальций - измерительного модуля фирмы Luigs und Neumann, Германия. Этот же модуль являлся интерфейсом предварительной обработки.

Оптическая часть установки была смонтирована на базе микроскопа Axioskop, Zeiss. Разделение потоков возбуждающего света и флуоресценции производилось при помощи дихроического зеркала. Свет, прошедший через фильтр для возбуждения флуоресценции, отклонялся дихроическим зеркалом и при помощи высокоаппертурного иммерсионного объектива (40*, апертура 0.75) фокусировался на объекте. Флуоресцентный свет проходил через соответствующий интерференционный фильтр и подавался на фотоэлектронный умножитель (ФЭУ). Для уменьшения уровня шумов фиксированная диафрагма (1 мм) была расположена перед ФЭУ. В результате флуоресцентный сигнал собирался с фокальной плоскости диаметром 50 мкм, что позволило значительно улучшить соотношение сигнал/шум.

Модуль предварительной обработки позволял производить компенсацию автофлуоресценции и, при необходимости, усиливать сигнал, после чего он оцифровывался при помощи цифрового интерфейса TIDA и обрабатывался компьютером при помощи программ Tida 5.0 и Wintida, разработанных в Гейдельберге, Германия.

 

Рисунок 4. Принципиальная схема экспериментальной установки для двухволнового измерения кальция.

5. Растворы и смена растворов

При работе со срезами все растворы готовились на основе раствора Тироде (в ммоль/л): NaCl - 125, KCl - 5.4, MgCl2 - 1, CaCl2 - 2.5, NaHCO3 - 26, KH2PO4 - 1.6, глюкоза - 10, постоянно аэрировавшийся газовой смесью 95% О2 + 5% СО2 (pH=7.4). Бескальциевый раствор готовился эквимолярной заменой CaCl2 на MgCl2 и добавкой 1 ммоль/л EGTA, растворы с повышенным содержанием калия или кофеина - заменой NaCl на соответствующее количество KСl или кофеина.