Атф индуцированное изменение внутриклеточной концентрации кальция в нейронах неокортекса крыс

Смена растворов производилась протоком, скорость которого можно было варьировать от 10 до 20 мл/мин. Объем экспериментальной камеры составлял 0.5 мл. Все эксперименты были проведены при температуре (32 °С).

 

 

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Аппликация АТФ в большинстве нейронов моторной коры (98 из 102) вызывает быстрое и кратковременное повышение концентрации цитозольного кальция [Ca2+]i . Концентрация [Ca2+]i достигает своего максимума на протяжении 6-8 секунд и затем восстанавливается до базального уровня при продолжающемся присутствии АТФ. Отмывание АТФ приводит к восстановлению [Ca2+]i до уровня покоя. Характерный вид АТФ - индуцированного кальциевого транзиента представлен на рисунке 5.

 

Амплитуда АТФ - индуцированного кальциевого транзиента варьировалась в пределах от 50 до 450 нМ. Среднее значение выброса [Ca2+]i вызванного приложением АТФ в концентрации 100 мкМ находилось в пределах 200-250 нМ.

Наблюдалась доза - зависимость амплитуды ответа от концентрации АТФ в пределах от 10 до 2000 мкМ. На рисунке 7 представлена апроксимация экспериментальных точек сигма - функцией. Концентрация АТФ, при которой амплитуда ответа составляет половину максимальной, - 220 ±± 20 мкМ.

Целью наших исследований было определение подтипов пуринорецепторов вовлеченных в генерацию [Ca2+]i транзиента. Известно, что АТФ активирует несколько типов пуринорецепторов, а именно Р2 пуринорецепторы подтипов Р2х и Р2у (Peter Illes et al, 1993, Burnstock and Kennedy 1985), а также Са2+ каналы плазмалеммы (Кришталь, 1983).

С целью обеспечения достоверности полученных данных, принимая во внимание тот факт, что работа проводилась на тонких срезах мозга, мы провели серию экспериментов с подавлением распостранения потенциалов действия с помощью тетродотоксина (TTX). При использовании TTX выяснилось, что амплитуда и форма [Ca2+]i транзиентов не изменяется или изменяется незначительно. Полученные результаты позволяют нам предполагать, что получаемые нами данные отображают процессы происходящие в отдельной наблюдаемой клетке. К сожалению мы не имели возможности проводить все эксперименты c тетродотоксином из-за дороговизны препарата. Для изучения характеристик рассматриваемых пуринорецепторов, принимающих участие в генерации [Ca2+]i транзиента, применялись следующие протоколы экспериментов.

 

1. Приложение АТФ в растворе не содержащем Ca2+. Удаление кальция из внеклеточного раствора незначительно влияло на кальциевый транзиент, вызванный аппликацией 10 мкМ АТФ, но в тоже время подавляло на 45% ±± 7% кальциевый транзиент вызванный 100 мкМ АТФ. (Рис. 8).

 

 

Для исследования способности внутриклеточного Ca2+ депо к перезаполнению мы последовательно апплицировали АТФ несколько раз с интервалом в 60 секунд в обычном растворе и в растворе не содержащем Ca2+ . Как видно из рисунка 9 вторая аппликация АТФ вызывала Ca2+ транзиент меньшей (на 30% ± 4%) амплитуды по сравнению с первой (контрольной) аппликацией. Последующие аппликации АТФ разделенные 60 ти секундным интервалом не вызывали заметного уменьшения амплитуды [Ca2+]i транзинета по сравнению со второй аппликацией в стандартном растворе

 

В бескальциевом растворе - наоборот, вторая аппликация АТФ вызывала значительное уменьшение Ca2+ транзиента на 40% ± 5% от контроля. Последующие аппликации АТФ в бескальциевом растворе приводили к последовательному уменьшению амплитуды [Ca2+]i транзиента и после двух - трех последовательных аппликаций сигнал исчезал вообще (рисунок 10). Такое уменьшение вероятно обусловлено истощением внутриклеточных депо.

 

 

1. Ингибирование захвата Ca2+ эндоплазматическим ретикулом тапсигаргином (спецефическим блокатором Ca2+ насоса эндоплазматического ретикулума) уменьшало [Ca2+]i транзиенты, вызванные приложением АТФ, на 63% ± 5% для концентрации АТФ 100 мкМ АТФ (рис. 11). Как видно из рисунка 11 приложение тапсигаргина не влияло на базальный уровень Ca2+ в клетке.
 

1. Приложение кадмия в концентрации 50 мкМ, верапамила в концентрации 100 мкМ и 50 мкМ никеля обратимо уменьшало амплитуду [Ca2+]i транзиента вызванного приложением 100 мкМ АТФ на 35%, 20%, и 15% сответственно. Данные представлены на рисунке 12.

 

Приложение различных агонистов пуринорецепторов вызывало различные по амплитуде ответы. Порядок относительной активности лигандов для данного объекта был следующим ATPgS > ATФ = AДФ >> a,b-methylene ATP » AMФ > УТФ>> аденозин (ADO), данные преставлены на рисунке 13.

 

 

Сурамин, известный антагонист Р2 типа пуринорецепторов, уменьшал [Ca2+]i транзиенты, вызванные приложением 100 мкМ АТФ на 76% ± 7% и также не изменял концентрацию [Ca2+]i  в покое. Данные представлены на рисунке 14.

 

 

 

5. ОБСУЖДЕНИЕ

При исследовании средних слоев неокортекса крыс мы обнаружили их способность отвечать на приложение АТФ. Таким образом мы можем сделать вывод о наличии в данном объекте пуринорецепторов. Ответ на АТФ является доза - зависимым с амплитудой половинного ответа в 220 нМ. Последовательные приложения АТФ, после второго приложения, не вызывали уменьшения амплитуды [Ca2+]in транзиентов. Из этого можно сделать вывод об отсутствии десенситизации данного типа рецепторов.

Исследуя источники повышения цитозольного кальция мы обнаружили, что АТФ активирует как ионотропные так и метаботропные рецепторы. Блокаторы потенциал - управляемых кальциевых каналов такие как кадмий, никель и верапамил уменьшали АТФ - индуцированные кальциевые транзиенты на 35% - 15%, что говорит об опосредованном АТФ активировании потенциал - управляемых каналов.

Для исследования активацию метаботропных рецепторов. Для этого мы прилагали АТФ в бескальциевом растворе, - амплитуда ответа при этом уменьшалась на 45% ± 7%. Этот результат говорит о том, что внутриклеточные депо принимают участие в генерации [Ca2+]in ответов, причем их вклад близок к половине. При повторных аппликациях АТФ в бескальциевом растворе Ca2+ ответ исчезал полностью после второй аппликации, т.е. внутриклеточные депо полностью истощаются. Исследуя путь высвобождения внутриклеточного кальция мы апплицировали тапсигаргин - спецефический блокатор АТФ - азы эндоплазматического ретикулума. [Ca2+]in транзиенты уменьшались на 63% ± 5% в присутствии тапсигаргина. Аппликация коффеина, агониста рианодиновых рецепторов, в клетках моторной коры 14 дневных крыс не вызывали повышения уровня [Ca2+]in . Следовательно выброс [Ca2+]in из внутриклеточного депо происходит по IP3 - чувствительному механизму.

В дальнейшем мы исследовали более подробно типы присутствующих пуринорецепторов. Построив ряд активности агонистов для Р1 и Р2 пуринорецепторов по амплитудам ответов, мы сделали заключение базирующееся на отсутствии ответа на аденозин, что в нашем объекте присутствуют только Р2 пуринорецепторы. Проводя дальнейшую субклассификацию Р2 типа рецепторов мы использовали сурамин - блокатор некоторых типов Р2х и Р2у рецепторов. Приложение сурамина уменьшало амплитуду [Ca2+]i транзинета вызванного приложением 100 мкМ АТФ на 76% ± 5%, что говорит о наличии этих типов рецепторов в исследуемом объекте.

 

 

6. ВЫВОДЫ

1. Приложение АТФ в различных концентрациях вызывает Ca2+ транзиенты в клетках моторной коры крыс.
2. Ответ на АТФ является доза - зависимым с амплитудой половинного ответа в 220 нМ.
3. АТФ активирует как ионотропный так и метаботропные пути повышения внутриклеточного кальция.
4. В генерации АТФ индуцированного повышения [Ca2+]in принимают участие некоторые типы потенциал - управляемых кальциевых каналов.
5. Высвобождение внутриклеточного кальция происходит из IP3 чувствительных депо.
6. В данном объекте присутсвуют только Р2 подтипы пуринорецепторов.
7. Сурамин - антагонист Р2Х2 и Р2Х5 и Р2У рецепторов уменьшает амплитуду [Ca2+]in транзиенты, что говорит присутствии некоторых из вышеперечисленных рецепторов.

 

 

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. A.Shmigol, A.Verkhratsky & G. Isenberg (1995): Calcium-induced calcium release in rat sensory neurones. Journal of Physiology (London), 489.3 627-636.
2. A.Shmigol, G. Isenberg, P.Kostyuk & A. Verkhratsky (1994): Calcium-induced Ca2+ release from internal stores in rat dorsal root ganglion neurones. In: European Journal of Neuroscience, Suppl. 7, Proceedings of the 16th Annual ENA Meeting, p. 146.
3. A.Shmigol, N.Svichar, P.Kostyuk & A.Verkharatsky. (1995): “Incremental” caffeine-induced calcium release in mouse sensory neurones. European Joutnal of Neuroscience, Supple №  8. p111. Proceedings of the 16th Annual ENA Meeting.
4. A.Shmigol, Yu.Usachev, N.Pronchuk, S.Kirischuk, P.Kostyuk & A.Verkhratsky (1994): Properties of the caffeine sensitive intracellular calcium stores in mammalian neurons. Neurophysiology /Neirophiziologia, v. 26 No. 2, p. 16 - 25.
5. A.Verkhratsky, A. Shmigol, S. Kirischuk, N. Pronchuk & P. Kostyuk (1994): Age-dependent changes in calcium currents and calcium homeostasis in mammalian neurons. Annals of the New York Academy of Sciences, v. 747, p365 - 381.
6. Abbracchio, M. P., Burnstock, G. (1994) Purinoceptors: are there families of P2x and P 2y purinoceptors? Pharmac. Ther. 64: 445-475
7. Anatoly Smigol, Platon Kostyuk, Alexey Verhratsky (1994) Role of caffeine-sensitive Ca2+ stores in Ca2+ signal termination in adult DRG neurones // NeuroReport v.5, 2073-2076.
8. Anatoly Smigol, Sergey Kirischuk, Platon Kostyuk, Alexey Verhratsky (1994) Different properties of caffeine-sensitive Ca2+ stores in peripherial and central mammalian neurones // Pflugers Arch v.426, 174-176.
9. Baker P. F., Blaustein M.P., Hodgkin A.L. and Steinhardt R. A. (1969) The influence of calcium on sodium efflux in squid axons. J. Physiol., Lond. 200, 431-458.
10. Bean B.P. (1992) Pharmacology and electrophysiology of ATP-activated ion channels. Trends Pharmacol. Sci. 13, 87 - 90.
11. Belan P., Kostyuk P., Snitsarev V. and Tepikin A. (1993) Calcium clamp in isolated neurones of the snail Helix pomatia. J. Physiol., Lond. 462, 47 - 58.
12. Bronner, F. (1990). Intracellular Ca2+ regulation.. New York: Wiley-Liss.
13. Burk S. E., Lytton J. , MacLennan D. H. and Shull G. E. (1989). cDNA cloning, functional expressing, and mRNA tissue distribution of a third organellar Ca2+ pump. J. Biol. Chem. 164, 18561-18568.
14. Burnstock, G. (1972) Purinergic nerves. Pharmacol. Rev. 24: 509-581
15. Burnstock, G. (1978) A basis for distinguishing two types of purinergic receptor. in: book
16. Burnstock, G. (1990) Co-transmission. Arch. Int. Pharmacodyn. 304: 7-33
17. Burnstock, G., Kennedy, C.(1985) Is there a basis for distinguishing two types of P2 purinoceptor? Gen.Pharmacol. 16: 433-440
18. Carafoli E. (1992) Calcium pump of the plasma membrane. Physiol. Rev. 71, 129 - 153.
19. Chen, C.-C., Akopian, A.N. et al, (1995) A P2x purinoceptors expressed by a sybset of sensory neurones. Nature 377: 428 - 431
20. Кришталь О.А., Марченко С.М. (1983). Рецепторы АТФ в сенсорных нейронах млекопитающих. Докл. Акад. Наук УССР.
21. Gianini G., Clementi E., Ceci R., Marziali G., and Sorremtino V. (1992) Expression of a ryanodine receptor Ca2+ that is regulated by TGF-b, Science, 257, 91 - 94.
22. Ginetta Collo et al, (1996) Cloning of P2X5  andP2X6 receptors and the distribution and properties of an extended family of ATP-gated ion channels. The J. of Neurosci. 16(8): 2495-2507
23. Gordon, J. L. (1986) Extracellular ATP: effects, sources and fate. Biochem.J. 233: 309-319
24. Grynkiewicz, G., Poenie, M., and Tsien, R.Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescent properties. J. Biol. Chem., 260, 3440-3450, 1985.
25. Heizmann C.W. and Hunziker W. (1991) Intracellular calcium-binding proteins: more sights than insights. Trends Biochem. Sci. 16, 98 - 103.
26. Heschler J. and Schultz G. (1993) G-proteins involved in the calcium channel signalling system. Curr. Opin. Neurobiol. 3, 360-367.
27. Hiderman, R. H., Martin, M., Zimmerman, J. K., Pivorun, E. B. (1991) Identification of a unique membrane receptor for adenosin 5¢,5¢¢¢- P1,P4-tetraphosphate. J. Biol. Chem. 266: 6915-6918
28. Hoyle, C. H. V. (1990) Pharmacological activity of adenine dinucleotides in the periphery: possible receptor classes and transmitter function. Gen. Pharmacol. 21: 827-831
29. Hymel L., Inui M., Fleischer S. and Schindler H. (1988). Purified ryanodine receptor of skeletal muscle sarcoplasmic reticulum forms Ca2+-activated oligomeric Ca2+ channels in planar bilayers. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 85, 441-445.
30. Kirischuk S.I., Voitenko N.V., Kettenmann H.O. and Verkhratsky A.N. (1994) Mechanisms of cytoplasmic calcium signalling in cerebellar Bergman glial cells // Neurophysiology v.26, 417-419.
31. Kirischuk, V.Matiash, A.Kulik, N.Voitenko, P.Kostyuk, A.Verkhratsky (1996) Activation of P2-purino, a1-adreno and H1-histamine receptors triggers cytoplasmic calcium signalling in cerebellar Pupkinje neurons // Neuroscience v.73, 643-647
32. Kostyuk and A. Verhratsky (1994) Calcium stores in neurones and glia //Neuroscience v. 63, N.2, 381-404.
33. Kostyuk P. G. (1992). Calcium ions in nerve cell function. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press.
34. Kuno M., Maeda N. and Mikoshiba K. (1994) IP3-activated Ca2+-permeable channels in the incide-out patches of cultured cerebellar Purkinje cells. Biochem. Biophys. Res. Comm. 199, 1128 - 1135.
35. Lуckhoff A. and Clapham D.E. (1992) Inositol 1,3,4,5-tetrakisphosphate activates an endothelial Ca2+-permeable channel. Nature 355, 356-358.
36. Londos, C., Cooper, D. M. F., Wolff, J. (1980) Subclasses of external adenosine receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 2551-2554
37. Lytton J., Westlin M. and Hanley M. R. (1991). Thapsigargin inhibits the sarcoplasmic or endoplasmic reticulum Ca-ATPase family of calcium pums. Biol. Chem. 266, 17067-17071.
38. Mackgrill J. J. and Lai F. A. (1994). Solubilization of the type 3 ryanodine receptor from rabbit brain. Biophys. J. 66, A147
39. McPherson P. S., Kim Y. K., Valdivia H., Knudson C. M., Takekura H., Franzini-Armstrong C., Coronado R. and Campbell K. P. (1991). The brain ryanodine receptor: A caffeine-sensitive calcium release channel. Neuron 7, 17-25.
40. N.Voitenko, S.Kirischuk, A.Kulik, A.Verkhratsky (1995) Calcium signalling in granule neurones of the mouse cerebellar slices // Pflugers Archiv European Journal of Physiology, v.430, Supplement 4, R124.
41. Nicholls D.G. (1985) A role for the mitochondria in the protection of the cell against calcium overload. Prog. Brain Res. 63, 97-106.
42. Pintor, J., Diaz-Rey, M. A., Torres, M., Miras-Portugal, M. T. (1992) Presence of diadenosine polyphosphates-Ap4A and Ap5A-in rat brain synaptic terminals. Ca2+-dependent release evoked by 4-aminopyridine and veratridine. Neurosci. Lett. 136: 141-144
43. Ribeiro, J. A., Sebastiao, A. M. (1986) Adenosine receptors and calcium: basis for proposing a third (A3) adenosine receptor. Prog. Neyrobiol. 26: 179-209
44. Rios E. and Pizarro C. (1991) Voltage-sensor of excitation-contraction coupling in skeletal muscle. Physiol. Rev. 76, 849 - 908
45. Ross C. A., Danoff S. K., Schell M. J., Snyder S. H. and Ullrich A. (1992). Three additional inositol 1,4,5-trisphosphate receptors: Molecular cloning and differential localization in brain and peripheral tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 4265-4269.
46. S.Kirischuk, N.Voitenko, P.Kostyuk, A.Verkhratsky (1995) Calcium signalling in granule neurones studied in cerebellar slices // Cell Calcium v.18, 464-476
47. S.Kirischuk, N.Voitenko, P.Kostyuk, A.Verkhratsky (1996) Age-associated Changes of Citoplasmic Calcium Homeostasis in Cerebellar Granule Neurones in situ: Investigation on Thin Cerebellar Slices. // Experimental Gerontology
48. S.Kirischuk, N.Voitenko, T.Moller, H.Kettenmann and A.Verkhratsky (1995) ATP-induced cytoplasmic calcium mobilization in bergman glial cells // J. Neuroscience v.15, 8234-8248.
49. Scheggerburger R., Zhou Z., Konnerth A. and Neher E. (1993). Fractional contribution of calcium to the cation current through glutamate receptor channels. Neuron 11, 133-143.
50. Sergej Kirischuk and Alexej Verkhratsky (1996) [Ca2+]i recordings from neural cells in acutely isolated cerebellar slices employing differential loading of the membrane-permeant form of the calcium indicator fura-2 // Pflugers Arch. -Eur. J. Physiology v.431, 977-983
51. Sergej Kirischuk, Nana Voitenko, Platon Kostyuk, Alexej Verkhratsky (1996) Calcium signalling in granule neurones studied in cerebellar slices // Cell Calcium v.19, 59-71
52. Shmigol A., Kirischuk S., Kostyuk P. and Verkhratsky A. (1994). Different properties of caffeine-sensitive Ca2+ stores in peripheral and central mammalian neurones. Pflьgers Arch. 426, 174-176.
53. Shmigol, D.Eisner & A.Verkhratsky (1995): Cyclic ADP ribose enhances Ca2+-induced Ca2+ release in mouse sensory neurones. Journal of Physiology, London, v. 483P, p63P.
54. Shmigol, N. Svichar, P. Kostyuk & A. Verkhratsky (1996) Gradual caffeine-induced Ca2+ release in mice DRG neurones is controlled by cytoplasmic and intraluminal Ca2+. Neuroscience, 73 N 4, 1061-1067
55. Shmigol, P. Kostyuk & A. Verkhratsky (1995): Thapsigargin blocks plasmalemmal voltage-operated calcium channels in mouse DRG neurones. Journal of Physiology, London, v. 483P, p64P.
56. Soltoff, S. P., McMillian, M.K., Talamo, B.R., Cantley, L. C.(1993) Blockade of ATP binding site of P2 purinoceptors in rat parotid acinar cells by isothiocyanate compounds. Biochem. Pharmacol. 45: 1936-1940
57. Tatsumi H. and Katayama Y. (1993) Regulation of intracellular free calcium concentration in acutely dissociated neurones from rat nucleus basalis.J.Physiol., Lond.464,165-181.
58. Tepikin A. V., Kostyuk P. G., Snitsarev V. A. and Belan P. V. (1992a). Extrusion of calcium from a single isolated neuron of the snail Helix pomatia. J. Membrane Biol. 123, 43-37.
59. Thayer S.A. and Miller R.J. (1990) Regulation of the intracellular free calcium concentration in single rat dorsal root ganglion neurones in vitro. J.Physiol. (London), 425, 85 - 115.
60. Ursula Windscheif, (1996) Purinoceptors: from history to recent progress. Review. J. Pharm. Pharmacol. 48: 993-1011
61. Van Calker, D., Muller, M., Hamprecht, B. (1979) Adenosine regulates via two different types of receptors, the accumulation of cyclic AMP in cultured brain cells. J. Neurochem. 33: 999-1005
62. Verkhratsky & A.Shmigol (1996) Calcium-induced calcium release in neurones. Cell Calcium, v.19, No 1, 1-14.
63. Voitenko N., Kirischuk S., Verkhratsky A. (1995) Mechanisms of cytoplasmic calcium signalling in cerebellar granule neurones in situ. // Експериментальна та клінічна фізіологія, збірник наукових праць до 100-річчя кафедри фізіології Львівського медичного університету, р.357.
64. Zhou Z. and Neher E. (1993). Calcium permeability of nicotininc acetylcholine receptor channels in bovine adrenal chromaffine cells. Pflugers Arch. 425, 511-517.
65. Zhou Z. and Neher E. (1993). Mobile and immobile calcium buffers in bovine adrenal chromaffin cells. J.Physiol., Lond. 469, 245-273.