Феномен РНК-интерференции

Феномен РНК-интерференции

Одним из способов получения  новых сортов декоративных растений, например, петуний, цветы которых  обладали бы более яркими бордовыми  лепестками, является введение в клетки растения гена, отвечающего за синтез красного пигмента. К удивлению селекционеров, многие цветы после введения дополнительной копии гена, вместо того, чтобы усилить окраску, вовсе теряли пигмент и оказывались белыми. С этого и других похожих наблюдений, сделанных в начале 90-х годов ХХ столетия, и началась история малых интерферирующих РНК.

В других экспериментах у одного из самых популярных в последнее  время модельных организмов –  кольчатого червя Caenorhabditis elegans (C. elegans), молекулярные биологи, изучавшие вопросы генетической регуляции, пытались усилить работу определенных генов путем введения в клетки червя дополнительных копий этих генов. И снова, вместо усиления экспрессии данных генов, наблюдался противоположный эффект: его полное «замолкание».

Длительное время никто не мог  объяснить наблюдаемые феномены, рассматривая их как артефакты. И лишь спустя годы удалось установить, что во всех подобных случаях в клетках подопытных организмов появлялись большие количества особых «малых» РНК. Еще большее удивление вызвали результаты исследований структуры этих молекул. Оказалось, что данные РНК являются копией отдельных участков тех самых генов, которые вводились в клетку, и активность которых вопреки ожиданиям подавлялась.

Мало того, с одной стороны, структура  этих «малых» РНК однозначно указывала  на то, что они были скопированы с введенной в клетку ДНК, что для клетки вполне нормально. С другой стороны – вместо того, чтобы, как в случае информационных РНК, служить матрицей для синтеза белков и способствовать, тем самым, усилению выраженности гена (например, усиливая цвет петуний), эти РНК каким-то образом препятствовали экспрессии генов. Начиная с 1995 года, исследователи предприняли попытки воспроизвести этот эффект экспериментально. Для этого были искусственно синтезированы небольшие молекулы РНК, являющиеся почти точной копией какого-либо небольшого участка определенного гена, и вводили эти РНК различным организмам.

Первое подтверждение феномена «замолкания» генов было получено у C. elegans. Немного позже это свойство коротких РНК выявили у мух и, наконец, в 2001 году – при введении в клетки мыши и человека. В том же 2001 году журнал Science включил исследования малых РНК в число наиболее важных. Почему же короткие РНК способны выполнять столь необычные функции. Решение парадокса малых РНК началось с детального изучения их структуры, биологических характеристик и путей их превращений в клетках различных организмов.

Длительное время исследователи  не обращали особого внимания на короткие клеточные РНК, полагая, что их роль в клетке не слишком значительна. Гораздо больший интерес вызывали другие типы РНК, а именно информационные, транспортные и рибосомальные. Эти классы РНК имеют определенные размеры, часто являясь очень длинными молекулами, содержащие до 100 000 нуклеотидов.

Понятно, что с первого взгляда  «малые» РНК, состоящие всего из нескольких десятков нуклеотидов, могли показаться просто клеточным «мусором», фрагментами деградации других видов РНК. И даже несмотря на то, что участие отдельных малых молекул РНК в процессах сплайсинга иРНК было доказано ранее, новой страницей в молекулярной биологии малых РНК стало открытие их способности подавлять экспрессию генов у животных.

В нормально работающей клетке каждый ген выполняет собственную, строго определенную функцию, например, направляет синтез белка с помощью предварительного образования иРНК или регулирует другие клеточные процессы путем взаимодействия с регуляторными белками. При этом имеет место обычная экспрессия гена в клетке. Эффект «гашения» экспрессии определенных генов малыми РНК получил название РНК-интерференции, а молекулы, вызывающие его, назвали малыми интерферирующими РНК – siRNA (small interfering RiboNucleic Acids). Далее будет использоваться англоязычное сокращение термина, так как соответствующая русская аббревиатура пока не является общепринятой. С открытием молекул siRNA и явления РНК-интерференции, в целом, стало ясно, что этот феномен может иметь огромное практическое значение.

Почему же именно siRNA вызвали столь  бурный всплеск интереса. Ведь в  распоряжении биологов имеется целый  набор других подходов и методов, позволяющих заставить ген «замолчать»: – от использования антисмысловой ДНК и различных химических блокаторов до возможности «выключать» гены во всем организме путем внесения необходимых мутаций в зиготу. Ответ на этот вопрос можно найти, познакомившись со структурой и свойствами siRNA более детально.

К классу малых РНК вообще относят  молекулы, содержащие от 20 до 300 рибонуклеотидов. За эффект РНК-интерференции отвечают самые короткие из них – siRNA, состоящие  всего из 21-28 (у млекопитающих из 21-23) нуклеотидов. Структурной особенностью этих молекул является то, что они, в отличие от большинства других клеточных РНК, состоящих всего из одной цепи нуклеотидов, являются двухцепочечными. Нуклеотиды двух цепей siRNA спариваются друг с другом по тем же законам комплементарности, которые формируют двуцепочечные молекулы ДНК в хромосомах. Кроме того, по двум концам каждой siRNA всегда присутствуют одноцепочечные уступы из двух неспаренных нуклеотидов (на 3'-концах).

Структуру siRNA определили, выделив их из клетки. Но как siRNA появляются в клетке, например, после введения дополнительной копии гена, как это было в случае с петунией. Очевидно, в клетке должен существовать некий молекулярный механизм, который обеспечивал бы синтез siRNA, их накопление в клетке и позволял бы им выключать гены. Исходя из этих предположений, а также теоретически определив круг наиболее вероятных участников процесса РНК-интерференции, исследователи начали  поиск реальных компонентов, отвечающих за ее реализацию. И хотя все детали этого процесса до сих пор неизвестны, одна из главных закономерностей была установлена: ученым удалось выявить систему ферментов, которая во многом схожа у всех многоклеточных и некоторых одноклеточных организмов (см. рис. 1).

Если молекула siRNA по тем или  иным причинам появляется в клетке, она сразу же взаимодействует  со специфической клеточной системой белков, для которых появление siRNA является сигналом к такому взаимодействию.

На первом этапе с молекулой siRNA связываются ферменты геликаза и нуклеаза (см. этап 1 на рис. 1), формируя комплекс RISC (RNA-induced silencing complex; от англ. silence – молчать, замолкать; silencing – замолкание). Как в англоязычной, так и специальной литературе этим термином называют процесс «выключения» гена. Геликаза, в силу своей специфичности, раскручивает цепи siRNA, в результате чего они расходятся (этап 2). Одна из этих цепей, с которой связана нуклеаза, теперь получает возможность связаться с комплементарным ей участком одноцепочечной мРНК (этап 3), позволяя нуклеазе разрезать ее. Разрезанные же участки мРНК подвергаются действию других клеточных РНКаз, которые обеспечивают их дальнейшую деградацию (этап 4).

Итак, основная «специальность» siRNA в  клетке – это блокирование тех  генов, которые соответствуют одной  из цепочек в составе siRNA. Но зачем  механизм РНК-интерференции существует в клетках? Какие процессы он призван регулировать? Что собой представляют те иРНК, на которые направлено действие малых РНК, и почему их необходимо уничтожать?

Один из ответов на вопрос о необходимости  РНК-интерференции в клетке, поставленный выше, напрашивается сам собой: с  помощью siRNA клетка может защищать себя от проникновения вирусов.

Геном некоторых из них состоит  из ДНК, у некоторых – из РНК, причем, РНК у вирусов может быть как  одно-, так и двухцепочечной. Сам  процесс разрезания чужеродной вирусной мРНК в этом случае происходит также путем активации комплекса ферментов RISC. Однако для большей эффективности растения и насекомые изобрели своеобразный путь усиления защитного действия siRNA (этапы 5-7 на рис. 1). Присоединяясь к цепи мРНК, участок siRNA может с помощью специфического комплекса ферментов, называемого DICER, сначала достроить вторую цепочку мРНК, а затем разрезать ее в разных местах, создавая, таким образом, разнообразные «вторичные» siRNA. Они, в свою очередь, формируют комплексы RISC и обеспечивают полную деградацию чужой т.е. вирусной мРНК. Такие «вторичные» молекулы смогут специфично связываться не только с тем участком вирусной мРНК, к которому была направлена «первичная» молекула, но также и с другими участками, что резко усиливает эффективность клеточной защиты.

Таким образом, у растений и низших животных организмов siRNA являются важным звеном своеобразного «внутриклеточного  иммунитета», позволяющего распознавать и быстро уничтожать чужую РНК. В  том случае, если в клетку проник РНК-содержащий вирус, такая система защиты не даст ему размножиться. Если же вирусный геном представлен ДНК, система siRNA будет препятствовать образованию вирусных белков путем распознавания и разрезания необходимой для этого вирусной мРНК, образующейся в ходе транскрипции.

У млекопитающих, в отличие от насекомых и растений, работает другая система защиты. При попадании в дифференцированную клетку млекопитающего чужой РНК, длина которой больше 30 нуклеотидов, клетка начинает синтез интерферона. Интерферон, связываясь со специфическими рецепторами на клеточной поверхности, способен активировать в клетке целую группу генов. В результате в клетке синтезируется несколько видов ферментов, которые тормозят синтез белков и расщепляют вирусные РНК. Кроме того, интерферон может действовать и на соседние, еще не зараженные клетки, блокируя тем самым возможное распространение вируса.

Как можно заметить, обе системы  во многом схожи: у них общая цель и «методы» функционирования. Даже сами термины «interferon» и «RNA interference»  происходят от общего корня. Но есть у них и одно очень существенное различие: если интерферон при первых признаках вторжения просто «замораживает» работу клетки, блокируя производство многих, в том числе и обычных клеточных белков, то система siRNA отличается чрезвычайной разборчивостью: каждая siRNA распознает и уничтожает только свою, специфическую мРНК. Замена всего лишь одного нуклеотида в последовательности siRNA ведет к резкому снижению эффекта интерференции.

В этом и заключается основное преимущество «находки 2002 года»: ни один из блокаторов генов, известных до сих пор, не обладает такой исключительной специфичностью по отношению к своему гену-мишени.

Однако, как видно на примере  многих опасных вирусных заболеваний  у людей, ни иммунная система, ни система  интерферона не способны обеспечить надежную защиту организма от вирусных инфекций. Поэтому самое время позаимствовать у природы уникальный опыт борьбы с вирусами. И почему бы не у растений или у насекомых? Ни те, ни другие не обладают системой адаптивного иммунитета. Чтобы выжить, растения были вынуждены «изобрести» РНК-интерференцию, которая до сих пор успешно защищает их клетки от внедрения вирусов. Появляется вполне закономерный вопрос: а нельзя ли применить этот же подход в отношении клеток животных и людей?

Действительно, открытие siRNA интересно  тем, что дает новую надежду в  борьбе с вирусами, в том числе  с ВИЧ, а также с теми из них, кого подозревают в соучастии  при развитии рака. Высокая специфичность  и эффективность siRNA вместе с их низкой токсичностью оказываются как нельзя кстати. Каким же образом, применяя терапию siRNA вместе с традиционными способами антивирусной терапии, можно достичь эффекта потенцирования, когда два разных воздействия приводят к более выраженному лечебному эффекту, чем простая сумма каждого из них, применяемого по отдельности.

Для того чтобы использовать механизм siRNA-интерференции в клетках  млекопитающих, в клетки нужно ввести уже готовые двухцепочечные молекулы siRNA. Оптимальный размер таких синтетических siRNA при этом должен составлять те же 21-28 нуклеотидов. Если увеличить ее длину – клетки ответят выработкой интерферона и снижением синтеза белка. Такие синтетические двухцепочечные РНК могут попасть как в зараженные, так и в здоровые клетки, и снижение синтеза белков в незараженных клетках окажется крайне нежелательным. С другой стороны, если попытаться применять siRNA меньшие, чем 21 нуклеотид, резко снижается специфичность ее связывания с нужной мРНК и способность к формированию комплексов RISC.

Если удастся разработать  какой-либо способ доставки siRNA, обладающей способностью связываться с одним из участков генома ВИЧ (который, как известно, состоит из РНК), можно попытаться не допустить его интегрирования в ДНК клетки хозяина. Кроме того, возможна разработка путей воздействия на различные этапы размножения ВИЧ в уже зараженной клетке. Последний подход не обеспечит излечение, однако может существенно уменьшить скорость размножения вируса и дать загнанной в угол иммунной системе шанс «отдохнуть» от вирусной атаки, и самой попытаться расправиться с остатками заболевания. На рис. 2 те два этапа размножения ВИЧ в клетке, которые, как надеются исследователи, можно заблокировать с помощью siRNA, отмечены красными крестами (это этапы 4-5 – встраивание вируса в хромосому, и этапы 5-6 – сборка вируса и выход из клетки).

Молекулярные биологи  полагают, что так же, как и  ВИЧ, можно блокировать на молекулярном уровне развитие и других заболеваний, в том числе опухолевых и инфекционных. На данный момент уже известна структура  генов и, соответственно, структура  мРНК многих мутантных молекул, которые участвуют, а иногда, как предполагается, и запускают развитие некоторых видов рака. Блокировав мРНК таких молекул с помощью РНК-интерференции, можно добиться, по крайней мере, ослабления прогрессии заболевания.

На сегодняшний день, правда, все вышесказанное относится лишь к области теории. На практике терапия siRNA встречается с затруднениями, обойти которые ученым пока не удается. Например, в случае антивирусной терапии именно высокая специфичность siRNA может сыграть злую шутку: как известно, вирусы обладают способностью быстро мутировать. Особенно отличается в этом ВИЧ, частота изменений которого такова, что у человека, заразившегося одним подтипом вируса, через несколько лет может быть выделен абсолютно непохожий на него подтип. В этом случае измененный штамм ВИЧ автоматически станет нечувствительным к siRNA, подобранной в начале терапии.