Феномен РНК-интерференции

Учитывая эти затруднения, ученые разрабатывают альтернативные варианты противовирусной siRNA-терапии. В случае ВИЧ, например, показано, что блокирование процесса образования CCR5, одной из молекул-рецепторов на клеточной поверхности, необходимых для прикрепления вируса к клетке (этап 6b на рис. 2), также может предотвращать заражение ВИЧ. Преимуществом данного подхода является то, что ген CCR5 и, соответственно, его мРНК, отличается (по сравнению с ВИЧ) гораздо большей стабильностью своего нуклеотидного состава, а, значит, подобрать для нее эффективную siRNA гораздо легче.

Существенный недостаток предполагаемой siRNA-терапии у человека – ее кратковременность. Ведь siRNA действуют не на сами гены, а только лишь на их продукты – молекулы мРНК, а у человека нет той системы усиления сигнала, которая присуща растениям и насекомым (этапы 5-7 на рис. 1). Кроме того, двухцепочечные молекулы siRNA чрезвычайно неустойчивы и недолговечны, поэтому эффект терапии закончится, как только они разрушатся и будут выведены из клетки. Для того чтобы терапия оказалась пролонгированной, необходимо вводить все новые siRNA.

Генная терапия пытается решить эту проблему, создавая специальные генетические конструкции на основе вирусных или бактериальных ДНК, в которые включены и гены, кодирующие необходимый для терапии тип siRNA. При попадании в клетку такие конструкции встраиваются в хромосомы, а гены siRNA превращаются в собственно молекулы siRNA с помощью клеточного механизма транскрипции. Таким образом, клетка сама получает возможность постоянно продуцировать новые и новые siRNA. Данные подходы уже опробованы и показали свою эффективность in vitro.

Но самым главным препятствием на пути разработки лекарств на основе siRNA являются сложности с их доставкой в клетки-мишени в пределах целого организма.

Во-первых, в крови на них действует  первый эшелон защиты организма, ферменты – нуклеазы, которые разрезают потенциально опасные и необычные для нашего организма двойные цепочки РНК. Во-вторых, несмотря на свое название – малые, siRNA все же достаточно длинны, а, главное, они заряжены, что делает невозможным их пассивное проникновение в клетку. И в – третьих, один из самых главных вопросов состоит в том, как заставить siRNA проникать только в больные клетки-мишени, не затрагивая при этом здоровые.

Все поставленные выше вопросы появились  задолго до открытия siRNA, и их преодоление  принципиально важно не только для  терапии siRNA, но и для генной терапии вообще. В решении этих вопросов исследователи уже сейчас достигли некоторого прогресса. Например, имеются попытки путем химических модификаций сделать молекулы siRNA более липофильными таким путем облегчить проникновение siRNA внутрь клетки. В свою очередь для обеспечения специфичности работы siRNA внутри только лишь определенных тканей, генные инженеры включают в состав своих конструкций специальные регуляторные участки, которые активируются и запускают считывание информации, заключенной в подобной конструкции (а значит, и синтез siRNA, если она туда включена), только в клетках определенных тканей.

Большинство экспертов сходится во мнении, что siRNA-терапия вряд ли станет панацеей от вирусов и рака. Однако создание на ее базе пусть даже не радикального, но все же действенного лекарственного средства будет очень важным шагом на пути разработки методов генной терапии. Можно сказать, что siRNA-терапия – это примерочный этап, на котором задачей экспериментаторов является отработка оптимальных условий целенаправленной доставки биомолекул в клетки пораженных тканей.

И все же разработка лекарств, несмотря на всю свою значимость, – не основное из предполагаемых применений siRNA. Самым  важным направлением в использовании  их свойств считают бурно развивающуюся в последнее время отрасль биологической науки –  функциональную геномику. После описания геномов многих животных и человека перед наукой встала очередная глобальная задача: выяснить роль каждого гена. Одним из основных инструментов, применяемых генетиками для решения этого вопроса, является «выключение» гена. Действительно, чтобы хотя бы в первом приближении оценить функцию гена, нужно посмотреть, как поведет себя клетка без него, какие биохимические процессы при этом нарушаются.

Именно в этом siRNA явились для  генетиков неоценимой находкой. Если раньше на поиски удачного способа  блокирования гена или приведения его  в действие требовалось от нескольких месяцев до года, то с помощью siRNA практически с любым геном  любого организма, последовательность нуклеотидов которого известна, эту процедуру можно осуществить в течение 1-2 недель, значительно повысив при этом специфичность блокирования. Действительно, у генетиков и молекулярных биологов есть повод для радости.

Выше были рассмотрены основные возможности «искусственного» применения siRNA для исследовательских и медицинских целей. Но если огромные возможности практического использования siRNA в науке и медицине более-менее очевидны, то с ее природной ролью в процессе жизни клеток пока остается больше вопросов, чем ответов. Как предполагают, роль коротких РНК не ограничивается только лишь защитой клеток от вирусов и других чужеродных РНК. Они, оказывается, были созданы, чтобы защитить нас ... от нас самих.

Дело в том, что геном любого многоклеточного организма включает в себя множество элементов, которые когда-то были привнесены в него в процессе эволюции извне, например, в результате встраивания вируса. Действительно, из всего материала, содержащегося в хромосомах человека, 34% приходится на долю элементов, называемых LINEs и SINEs (соответственно, Long и Short Interspersed Nuclear Elements), о функциях которых известно только то, что они могут время от времени копировать себя и перемещаться с одного места хромосомы в другое; те участки ДНК, которые достались геному человека от ретровирусов (8% генома) и транспозоны (3%) также способны менять свое место в геноме. На их фоне, как уже упоминалось в главе !!!, всего лишь 1-2 процента генов, кодирующих собственно клеточные белки, кажутся такой же маловажной деталью, как и siRNA среди огромного разнообразия своих других, крупных молекул РНК.

Элементы LINEs, SINEs, остатки ретровирусной  ДНК и транспозоны, за свою способность  к перемещениям именуемые подвижными, или мобильными генетическими элементами, представляют значительную опасность хромосом человека. Являясь так сказать «чужими среди своих», они, при определенных обстоятельствах, могут стать причиной внутриклеточного хаоса. Некоторые из них – остатки вирусов, или протоонкогены – способны при «включении» индуцировать рак; мобильные генетические элементы, размножаясь и перемещаясь, изменяют структуру хромосом, что может привести к мутациям. Например, у излюбленного объекта генетических исследований – плодовой мушки Drosophylla melanogaster – более 80% спонтанных мутаций возникают именно из-за необычного поведения ее собственных мобильных элементов. Их перемещения внутри генома настолько индивидуальны и непредсказуемы, что положение некоторых из них может служить «молекулярным паспортом», точно определяющим личность хозяина, что уже используется на практике.

Понятно, что каждому организму  необходимо было разработать систему  жесткого управления поведением мобильных  генетических элементов. Как раз  эту «надзирательскую» функцию, как полагают, и выполняет система внутриклеточных siRNA. На модели все того же C. elegans, например, было показано, что отключение генов, кодирующих некоторые из малых РНК, ведет к активизации перемещений мобильных элементов в его хромосомах и, соответственно, к повышению уровня мутаций.

Кроме того, ошибки в развитии органов  и тканей у подопытных животных, обнаруживаемые при отключении генов, кодирующих систему siRNA, а также высокая  активность системы siRNA в не дифференцированных клетках указывают на то, что механизм РНК-интерференции активно участвует в регуляции программы «созревания» клеток. Таким образом, процесс РНК-интерференции возможно играет одну из ключевых ролей в формировании целостного организма.

Еще одна из предполагаемых природных  функций siRNA – выявление неправильно обработанных копий других типов РНК в клетке.

Наконец, в 2002 году исследователи неожиданно выяснили, что действие siRNA может  не ограничиваться только лишь временным  выключением генов не уровне РНК. Имеются указания на то, что в  некоторых случаях siRNA, видимо, воздействуют на ДНК прямо, изменяя структуру хроматина и способствуя длительному «замолканию» одних, и, возможно, активизации других генов.

Как осуществляются все эти функции siRNA, каковы их молекулярные детали? Откуда, например, может появляться та необходимая для запуска реакции РНК-интерференции молекула двухцепочечной РНК? Если она создается в клетке намеренно, то какие ферменты отвечают за ее создание? Какие свойства сигнализируют о том, что молекула одноцепочечной РНК чужеродная или ошибочная и подлежит уничтожению? Каковы особенности функционирования системы siRNA у разных организмов, и почему они возникли именно в таком виде? Как появляются siRNA в клетке млекопитающих, у которых пока не выявлены ферменты, ответственные за достраивание второй цепочки siRNA?

На эти и многие другие вопросы  ответов пока нет. Каждый новый вопрос заставляет будущих профессоров  и академиков, Нобелевских лауреатов  и призеров Science искать ответ только лишь затем, чтобы задать новые вопросы  следующим поколениям.