Физиологическая функция каудальной нейросекреторной системы

МИНОБРНАУКИ РОССИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ БРЯНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ АКАДЕМИКА И.Г. ПЕТРОВСКОГО

 

                                      Кафедра зоологии  и анатомии

 

КУРСОВАЯ РАБОТА

Физиологическая функция каудальной нейросекреторной системы (КНСС)

                                                                                                                 Выполнила

Студентка 4 курса,  3 группы

Естественно – географического

факультета

Батынкова Ю.Ю.

Проверил:

к.м.н., профессор А.П. Бахтинов

 

 

 

 

 

 

Брянск 2014

 

 

 

 

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования: Данное исследование позволяет изучить основное значение КНСС и ее гормонов, антисыворотки UII.

 

Каудальная нейросекреторная система (КНСС) описана у костистой рыбы  Auguila Japonica японским ученым Enami в 1955 году. У нее КНСС рсполагается в хвостовом отделе спинного мозга и состоит из нейросекреторных клеток,  расположенных преимущественно в  передних его рогах. Они синтезируют нейросекрет, который по аксонам нейросекреторных клеток (НСК)  транспортируется  в вентральное выпячивание мозга, образованное глиоцитами, названное урофизом, который рассматривается как депо нейросекрета. [3]

     Со времени  открытия каудальной нейросекреции  Enami до 1999 года зарубежные ученые считали, что КНСС присуща исключительно рыбам. Даже работы Ganguli (1961), убедительно доказывающих наличие этой системы у амфибий – у одного из представителей позвоночных, что было воспринято критически и не воспринималось всерьез. Все мировой сообщество ученых по – прежнему исследовало каудальную нейросекрецию только у рыб, в том числе отечественные ученые Паленов А.Л., Саенко И.И.[3]

   Определенную роль  в доказательстве наличия КНСС  у других представителей животного мира имеют работы отечественных ученых К.А.Мещерская, А.П,Бахтинов., В.С.Бахтинова в 1977 когда был выделен короткий пептид из пояснично – крестцового отдела спинного мозга человека, доказан его контрацептивный эффект и получена специфическая сыворотка на кролике. В 1999 году способ выделения и очистки был подвержден авторским свидетельством СССР.

КНСС имеет ряд гормонов, а именно уротензин I,II,III,IV.[] Среди вышеперечисленных наиболее активный уротензин II. Он имеет специфический рецептор - UT в скелетной и гладкой мускулатуре, в гладкомышечных клетках в кардиомицетах, эндотелиоцитах и субэндотелии, в нейронах Центральной нервной системы и глиоцитах,  в частности, в астроцитах, поэтому его биологическое действие многостороннее, в том числе, на функцию ВНД.

 По своей биологической  активности уротензины относят  к древним регуляторным пептидам (И.П.Ашмарин, О.А.Гомазков, 1999 и другие). Это низко – и высокомолекулярные  соединения, представляющие собой  цепочку аминокислотных остатков, которые соединены между собой пептидной связью. Человеческий уротензин II, состоит из 11 аминокислот. При этом пептидные цепи спонтанно укладываются в сложные трехмерные структуры, что характерно для всех белков.

 Биологические эффекты  уротензина II человека осуществляются путем связи со специфическими рецепторами GPR -14\ SENR или UT. Этот рецептор обнаружен в ряде клеток, тканей, органов животных и человека. Эта система несомненно играет ключевую роль в развитиии и регуляции вазомоторного, секреторного, сенсорного и других процессов.

    Цель исследования: выявить основные физиологические функции каудальной нейросекреторной системы у животных и человека.

Задачи исследования:

1.   Рассмотреть влияние на поведенческие показатели животных.
2. Овладеть основными методиками исследования данной проблемы, овладеть навыками проведения эксперимента.
3. Научиться обрабатывать полученные данные.

 

 

 

 

 

 

                                   

 

 

 

 

                                      ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение

Глава 1. Литературный обзор.

1. Структура КНСС
2. Биохимическая и иммунологическая характеристика гормонов КНСС рыб
3. Биохимическая и иммунологическая характеристика короткого пептида КНСС человека и других позвоночных
4. Биохимический способ получения и очистки короткого пептида человека и млекопитающих

1.5. Изучение биологической активности короткого пептида КНСС

1.6. Определение единицы активности, влияние единицы активности короткого пептида КНСС человека на органы – мишени половых гормонов.

1.7.. Биологический метод исследования короткого пептида КНСС в эксперименте на животных

Глава 2. Влияние U II - гормона КНСС человека на системы органов

3.1. Влияние короткого пептида КНСС на половую и репродуктивную систему крыс

3.2. Влияние короткого пептида КНСС человека на сердечно – сосудистую систему  лягушки и электрокардиограмму крыс

3.3. Влияние короткого пептида КНСС человека на системное артериальное давление на примере котов и кроликов

3.4. Влияние короткого пептида КНСС человека в регуляции иммунитета и стресса

3.5. Влияние короткого пептида КНСС человека на работоспособность мышц

3.6. Этологическое исследование «Наблюдение поведенческих реакций самок мышей»

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выводы

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Биологическая, биохимическая, иммунологическая характеристика гормонов каудальной нейросекреторной системы

 

1. Биохимическая и иммунологическая характеристика гормонов КНСС

Структура и феномен нейросекреции КНСС, описанные Enami у костной рыбы, явились началом активного изучения различных аспектов этой нейросекреторной системы у обоих классов и всех подклассов пресноводных и морских рыб. Особое внимание зарубежными учеными  уделялось биохимическим, иммунологическим и другим исследованиям пептидов, выделяемых из урофиза и хвостовой части спинного мозга представителей позвоночных животных. [3]

  В 1990 году Conlon с соавторами, исследуя спинной мозг камбалы, получили из ее урофиза два гомогенно очищенных пептида примерно одинаковой концентрации, состоящих из 41 и 65 аминокислотных остатков. Эти факты позволили им высказать мнение, что второй пептид является проуротензином. Дальнейшее исследование ряда зарубежных ученых выделили  из мозга речной миноги, собачьей акулы, ската и костно – хрящевых рыб. Данные ученые считают, что U II у ранних позвоночных мог функционировать в ЦНС, скорее всего, как нейротрансмиттер, чем как нейрогормон. В 1999 году Couloam,  изучая топографию м-РНК и про – U II в ряде органов, провели анализ и показал, что он имеет циклическую часть, структура которой сохраняется от миноги до человека. Сохранение этой части эволюционно древнего пептида каудальной нейросекреторной системы у низко и высокоорганизованных позвоночных свидетельствует о биологически важной его значимости для всех  представителей этого вида животного мира.[15]

2. Биохимическая и иммунологическая характеристика короткого пептида КНСС человека и других позвоночных

В отличие от зарубежного сообщества ученых, занимающихся исследованием КНСС исключительно у рыб, владивостокские ученые независимо от них гораздо раньше открыли КНСС у человека, млекопитающих, птиц, амфибий и других позвоночных животных при попутных исследованиях постнатального гистогенеза эпендимы человека, когда был открыт интраспинальный орган человека (ИОЧ).[3]

   Его открытие в  процессе изучения этой проблемы, наличие в нем обильной васкуляризации и иннервации, а также активных оксидоредуктах, фосфатаз и секреторных включений П.А.Мотавкин, А.П.Бахтинов связывали с эндокринной функцией пояснично – крестцового отдела спинного мозга человека  в пределах от II поясничного до II –III крестцовых сегментов, где формируется ИОЧ – пептидный препарат, обладающий гипертензивным, иммуногенным и кардиотоническим эффектом. Иммуногенные свойства позволили получить специфическую сыворотку на кролике против данного пептида.[11]

  В качестве сырья  для получения короткого пептида КНСС использовался пояснично – крестцовый отдел спинного мозга трупов обоего пола здоровых людей в возрасте 30-45 лет, погибших в железнодорожных или автомобильных катастрофах, а также результаты убийств и самоубийств. Мозг брался в зимний период обычным путем спустя 2-6 часов после констатации смерти сотрудниками Приморской краевой и Брянской судебно-медицинской экспертизы. Каждый образец мозга помещался в чашку Петри и хранился в морозильной камере холодильника при температуре -180 С до момента выделения из него препарата, который затем использовался для биохимических, фармакологических и экспериментально – биологических исследований.[8]

 

3. Биохимический способ получения и очистки короткого пептида человека и млекопитающих

Короткий пептид КНСС человека и млекопитающих был получен по оригинальной методике А.П.Бахтинова3.3. Биохимический способ получения и очистки короткого пептида человека и млекопитающих. Короткий пептид КНСС человека и млекопитающих мы получали по оригинальной методике А.П. Бахтинова и соавторов (А.с. СССР № 689015). Несмотря на то, что этот способ лабор<1торного выделения гомогенного препарата весьма прост, им получают вполне чистый гомогенный препарат, что было доказано B.C. Бахтино-вой (1986) на основании диск-электрофореза по Мауреру (1963) на 7%-ном полиакриламидном геле и тонкослойной хроматографией на геле в ТИБОХ АН СССР (Владивосток). В настоящее время А.П. Бахтиновым и А.А. Бахтиновым разработан более совершенный метод получения пептидов КНСС (патент РФ на изобретение № 2224528, опубл. в БИ № 6 от 27.02.2004). Он требует более сложной аппаратуры и реактивов. Однако полученные новым и предыдущим способом пептиды КНСС проявляют абсолютно одинаковую специфическую для них биологическую активность, выделенные от ряда животных (крыс, мышей, быков, свиней, котов, кроликов, собак, лягушек и кур), независимо от метода выделения (B.C. Бахтинова, 1986; А.П. Бахтинов, И.Ю. Адамович, 1999; 2000; С.А. Лушкина, 20002; С.А. Лушкина, А.П. Бахтинов, 2002; С.А. Лушкина, О.Е. Изотова, 2002). Поэтому мы ограничились получением пептида первым лабораторным способом — более простым и доступным.[14]

Для этого замороженный спинной мозг животных или человека освобождают от твердой и мягкой мозговых оболочек, гомогенези-руют в дистиллированной воде, содержащей 0,05 М ЭДТА в соотношении 1:5. Полученный водный гомогенат ткани спинного мозга смешивают с хлороформом в соотношении 1 : 1 и сохраняют в холодильной камере при температуре +5 — 8 °С, в течение 1-го часа периодически встряхивают смесь для полной денатурации высокомолекулярных белков и лучшей экстракции пептида. Затем, при помощи лабораторной центрифуги ЦДН-2 при 8000±10% об/мин в течение 30 минут отделяют хлороформенную фракцию, а денатурированный белок и воду отбрасывают. Хлороформенный экстракт с помощью вентилятора высушивают в чашке Петри при температуре 15-18 градусов. Сухой хлороформенный экстракт гомогенезируют дистилированной водой. Полученную смесь осаждаюь  сульфатом аммония.

  Все проведенные биохимические  исследования свидетельсьвуют в пользу выделения нами короткого пептида, который на основе многочисленных экспериментов был идентифицирован как уротензин II (А.П. Бахтинов, 2005), названной вначале нами вазото-нином человеческим (Vasotoninum hominis) - V-H на основании первичных его биологических эффектов (К.А. Мещерская, А.П. Бахтинов, B.C. Бахтинова, 1977).[5]

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Глава 2. Определение основных биологических показателей короткого пептида КНСС человека

2.1. Изучение биологической активности короткого пептида КНСС человека

Первоначально биологическая активность выделенного гомогенного пептида испытана на кровеносных сосудах брыжейки лягушки. При этом артериальные сосуды значительно повышали свой тонус, уменьшаясь в диаметре в 2 - 3 раза. В связи с этим препарат назван вазотонином человеческим (Vasotoninum hominis) — V-H.

 

2.2. Определение единицы активности короткого пептида КНСС человека

Вначале она была определена на перфузионном сердце лягушки. За единицу активности принята такая концентрация препарата в растворе, которая вызывает увеличение частоты сердечных сокращений на 10±2,7 % от исходной. Определенная методом Лоури (Lowry, 1951), эта концентрация составила 0,5 мкг/мл протеина (V-Н). Это так называемая лягушачья доза (ЛД). При определении свойств препарата в остром опыте на кроликах массой 2,8 — 3,0 кг за единицу активности принималось количество препарата, которое вызывало у них повышение систольного артериального давления на 10± 1,5 % от исходного, что составляло 4 мкг/кг протеина по Лоури.[14]

 Исследование влияния единицы активности короткого пептида КНСС человека на органы-мишени половых гормонов

За единицу активности принималось количество препарата, которое вызывало снижение массы матки половозрелых крыс в фазе меж-течки в 1,5 раза по сравнению с контролем после введения определенного титра раствора данного препарата. Эксперимент длился 6 дней. Было доказано, что доза, вызывающая такое действие на матку крыс, соответствует 25 мкг/кг протеина, определяемого методом Лоури.[1]

При проведении дальнейших исследований на млекопитающих за терапевтическую (рабочую) дозу V-H принималась масса короткого пептида КНСС человека, равная 25 мкг/кг. Эта экспериментально обоснованная доза (25 мкг/кг) постоянно применялась в работе с гомойотерными животными.

Антиэстрогенный и антиандрогенный эффекты V-H были проверены нами на крысах обоего пола (К.А. Мещерская, А.П. Бахтинов, B.C. Бахтинова, 1977), когда учитывалось снижение массы матки у самок и уменьшение массы простаты у самцов крыс и контрацептивный эффект, наблюдаемый у особей обоего пола после соответствующего эксперимента, а также вазоактивный эффект; который и послужил причиной названия данного пептида вазотонином человеческим (Vasotoninum hominis) — V-H.[5]