Генотерапия

Значительно проще исправить  не сам дефект в гене, то есть заменить весь мутантный ген или его  повреждённый фрагмент на нормальный, а вводить в организм пациента полноценно работающий ген.

Работы по генной терапии  у человека ограничены в основном соматическими тканями, поскольку  манипуляции на половых или зародышевых  клетках могут привести к серьёзным  и непредсказуемым последствиям.

Уже разработанная и применяемая  на практике методика генной терапии  эффективна не только при лечении  моногенных заболеваний, но и таких широко распространённых патологий мультифакториальной природы (то есть вызванными генетическими и экзогенными факторами), как злокачественные опухоли, многие виды тяжёлых вирусных, сердечно-сосудистых и др. заболеваний.

Историческая  справка.

Первые клинические испытания  в генной терапии прошли в мае 1989 года. Т-лимфоциты, взятые из опухоли  у больного меланомой, были помечены прокариотическим геном neo, устойчивым к неомицину. Это позволило легко отделить эти клетки в культуре, а затем детально проследить их судьбу в кровотоке и избирательное накопление в опухолях.

Первым моногенным наследственным заболеванием, к которому применили методы генной терапии, стал наследственный иммунодефицит, обусловленный мутацией в гене фермента аденозиндезаминазы. 14-го сентября 1990 года в Бетесде (США) четырёхлетней девочке, страдающей этой достаточно редкой патологией (1:100000) пересадили её собственные лимфоциты, которые предварительно трансформировали in vitro геном АДА (ген АДА + ген neo + ретровирусный вектор). Лечебный эффект наблюдался в течение нескольких месяцев, после чего процедуру повторяли с интервалом в 3-5 месяцев. В результате лечения состояние пациентки настолько улучшилось, что она смогла вести нормальный образ жизни и не бояться случайных инфекций.

Большинство проектов в генной терапии (около 80%) касаются лечения  онкологических заболеваний, а также  ВИЧ-инфекции. Начаты клинические испытания  моногенных наследственных болезней и таких как:

Семейная гиперхолестеринемия (1992)

Гемофилия В (1992)

Муковисцидоз (1993)

Болезнь Гоше (1993)

Программы генной терапии  для клинических испытаний должны включать:

Обоснование выбора заболевания  для проведения такой терапии

Определение типа клеток, подлежащих генетической модификации

Схему конструирования экзогенной ДНК

Обоснование биологической  безопасности вводимой генной конструкции, включая опыты на культурах клеток и на модельных (трансгенных) животных.

Разработку её переноса в  клетки пациента

Методы анализа работы введённых генов

Оценки клинического (терапевтического) эффекта

Возможные побочные последствия  и методы их предупреждения.

В зависимости  от способа введения экзогенной ДНК в геном пациента генная терапия может проводиться либо в культуре клеток (ex vivo), либо непосредственно в организме (in vivo). Клеточная генная терапия или терапия ex vivo предполагает:

Выделение и культивирование  специфических типов клеток пациента.

Введение в них чужеродных генов.

Отбор трансфецированных клеток.

Реинфузию их тому же пациенту.

Генная терапия in vivo основана на прямом введении клонированных и определённым образом упакованных последовательностей ДНК в специфические ткани больного. Особенно перспективным для лечения генных болезней in vivo представляется введение генов с помощью аэрозольных или инъецируемых вакцин. Аэрозольная генотерапия разрабатывается, как правило, для лечения пульмонологических заболеваний (муковисцидоз, рак лёгких).

4)МЕТОДЫ ПЕРЕНОСА "ЛЕЧЕБНЫХ" ГЕНОВ

Метод генотерапии находится пока на ранней стадии развития, хотя выполнена значительная часть работы по созданию способов переноса генов лабораторным животным. Животные, несущие чужеродный ген, получили название трансгенных. Первые трансгенные мыши - основной объект для дальнейших исследований - были получены в 1981-1982 годах, а уже в 1985 году выбранные учеными гены были перенесены сельскохозяйственным животным (кроликам, свиньям и овцам) с целью улучшения полезных для человека свойств. Параллельно аналогичные успехи были достигнуты с растениями.

Первая успешная попытка  применить генотерапию в клинической практике была предпринята в 1990 году в США. Ребенку, страдающему редким заболеванием - тяжелым комбинированным иммунодефицитом, - которое связано с дефектом гена, кодирующего фермент аденозиндезаминазу, была введена неповрежденная копия гена. И хотя использованный метод предполагал многократное введение гена на протяжении всей жизни пациента, то есть, строго говоря, не обеспечивал полного излечения, была открыта новая эра в медицине.

Существуют несколько  подходов к лечению генами. Гены можно вводить в половые клетки (сперматозоиды или яйцеклетки), в клетки эмбриона на ранних стадиях  развития либо в соматические клетки (клетки тела, кроме половых или  их предшественников). Введение генов  в половые клетки означает, что  приобретенное свойство будет передаваться из поколения в поколение. Именно этот метод широко используется при  получении трансгенных животных, но он вряд ли применим к людям из этических соображений. Действительно, имеем ли мы право вмешиваться в эволюцию человека? Оправдан ли риск внесения в генофонд изменений, ведь мы еще не знаем всей сложной системы взаимодействия генов и их регуляции и, заменяя один "больной" ген, можем нарушить работу других и тем самым вместо ожидавшейся пользы принести вред, а может быть, и гибель человеку как виду. Генотерапия соматических клеток в отличие от половых затрагивает организм только самого пациента и поэтому разрабатывается в качестве основного подхода. При этом большое значение имеет правильный выбор типа соматических клеток, которые должны обеспечить длительное сохранение и функционирование внесенного "лечебного" гена.

Наследственные заболевания  могут быть обусловлены дефектом одного или нескольких генов, а также  крупными генетическими изменениями, например потерей целой хромосомы. Безусловно, на современном этапе  можно пытаться лечить генами только заболевания первого типа, так  называемые моногенные, при условии, если ответственный за дефект ген уже обнаружен и клонирован, то есть получен материал для введения больному.

В принципе существуют два  пути передачи больному "лечебного" гена. Если болезнь связана с отсутствием  или малыми количествами белкового  продукта дефектного гена, то достаточно ввести в клетку неповрежденный ген  и дать ему возможность работать; в результате появятся достаточные  количества белка-продукта. Таким образом, внесенная копия гена заместит по функциям сохраняющийся в геноме больного дефектный ген, поэтому  этот подход получил название заместительной терапии. Все используемые в настоящее  время клинические методы переноса генов основаны на внесении в клетку дополнительных количеств ДНК, то есть на заместительной терапии. Другим, идеальным  способом излечивать генетические заболевания  могла бы быть корректирующая (или  исправляющая) терапия, при помощи которой  дефектный ген реально заменялся  бы в геноме нормальной копией. Этого  можно достичь основываясь на способности двух молекул ДНК к рекомбинации - обмену при помощи специальных ферментов фрагментами полинуклеотидных цепей. Однако из-за крайне низкой эффективности этого метода в условиях лаборатории до практического использования корректирующей терапии пока очень далеко.

До сих пор мы не обсуждали, каким путем "лечебный" ген  может быть введен в клетки больного. Генетическая модификация соматических клеток может производиться либо непосредственно в организме  больного, либо путем введения функционального  гена в предварительно выделенные и  культивируемые клетки пациента, которые  затем возвращают обратно в организм. Оба способа имеют недостатки и ограничения, но в целом второй способ используется в настоящее  время чаще из-за своей большей  эффективности. В табл. 1 перечислены  разработанные методы введения ДНК  в животные клетки и указана их применимость для доставки генов  в культуру клеток или непосредственно  в орган. Химический метод доставки состоит в том, что если к очищенной  ДНК добавить ионы Ca2 + или некоторые  другие положительно заряженные соединения, то образующийся осадок поглощается  культивируемыми клетками. При этом лишь очень небольшая часть внесенной  ДНК проникает в ядра клеток, то есть эффективность переноса генов  крайне низка. Метод электропорации (создания микроскопических пор в мембранах клеток при помощи электрического высоковольтного разряда) несколько более эффективен, однако при этом возможны серьезные повреждения клеток. Оба описанных метода, равно как микроинъекция ДНК в отдельную клетку при помощи тонких стеклянных пипеток, не применяются для генотерапии. В отличие от микроинъекции обычная инъекция раствора ДНК шприцем и иглой может использоваться для переноса генов в некоторые ткани организма (например, в мышцы). В последние годы предложены новые способы доставки ДНК в соматические клетки, которые можно применять для лечения генами. Из физических методов следует назвать бомбардировку частицами, когда ДНК наносится на микроскопические металлические "дробинки" и выстреливается в клетку. Внесение ДНК в комплексе с липосомами - искусственными мембранными пузырьками, приготовленными из липидов, которые сливаются с плазматической мембраной клетки, - обеспечивает достаточно эффективный перенос в нее ДНК. Предлагается также использовать комплексы ДНК с белками, для которых на поверхности клетки имеются специфические рецепторы. После связывания рецептором белка чужеродная ДНК вместе с белком будет поглощена клеткой-мишенью. Наконец, еще один подход использует природную способность вирусов проникать в клетки и привносить в них собственный генетический материал. В последнее время на основе генетического материала вирусов создано множество генноинженерных конструкций, служащих векторами, то есть средствами доставки новых генов в клетки. Используют ретровирусные (их особенности будут пояснены позже) и аденовирусные векторы, а также векторы на основе некоторых других вирусов.

Главное в методе переноса генов - включается (интегрирует) ли новый  ген в хромосому клетки-мишени. Для активно делящихся клеток отсутствие интеграции внесенного гена в клеточную ДНК означает его  неминуемую утрату в клетках-потомках (рис. 1). Одной из основных причин того, что в 80% случаев для внесения чужеродной ДНК при клинических  испытаниях на людях использовали ретровирусные векторы, является его стабильная интеграция в клеточный геном. Кроме того, эти векторы обеспечивают высокую эффективность доставки генов и не приводят к ощутимым повреждениям в клетке-мишени. В отличие от ретровирусных аденовирусные векторы в геном не интегрируются. Далее мы подробнее остановимся на строении ретровирусов и векторов на их основе.

Так как генетическая информация записана в клетке в форме ДНК. На матрице ДНК синтезируются разные типы молекул РНК, один из которых (информационная, или матричная, РНК) направляет синтез белков. Это фундаментальное положение, сформулированное на заре молекулярной биологии, получило название основной догмы молекулярной биологии.

В своей первоначальной форме  основная догма гласила, что в  природе возможны синтез РНК на ДНК  и синтез белка под контролем  РНК, но ни в коем случае не в обратном направлении. Однако в 1970 году было установлено, что онкогенные, то есть вызывающие рак, РНК-содержащие вирусы животных (а все вирусы можно разделить на две большие группы в зависимости от того, какую нуклеиновую кислоту - ДНК или РНК - они содержат в качестве генетического материала) способны синтезировать ДНК на своей РНК как на матрице. Этот процесс получил название "обратной транскрипции" в отличие от прямой транскрипции ДНК РНК, а осуществляющие его вирусы, которые принципиально отличаются от остальных живых организмов по типу превращения генома, стали называть ретровирусами (от лат. retro - обратно, назад).

Сердцевина вируса, построенная  из специальных вирусных белков, содержит две идентичные молекулы одноцепочечной РНК, а также немногочисленные молекулы вирусных ферментов. Сердцевина окружена оболочкой, собранной из клеточных мембран хозяина с вкраплениями еще одного вирусного белка. Последний обеспечивает прикрепление вируса к поверхности клетки. Вслед за этим происходят "раздевание" РНК и ее проникновение вместе с белками сердцевины вируса в клетку, где специальный вирусный фермент катализирует обратную транскрипцию РНК в ДНК. Двухцепочечная вирусная ДНК перемещается в клеточное ядро и встраивается в хромосому. Это свойство ретровируса обеспечивает стабильное сохранение его генетической информации: реплицируясь вместе с клеточной ДНК при делении клетки, вирусспецифическая ДНК (провирус) передается в дочерние клетки. Провирус направляет синтез вирусных белков и РНК, которые затем собираются в частицы и выходят из клетки, отпочковываясь от клеточной мембраны. Еще одним уникальным свойством ретровирусов является то, что в составе их генома могут присутствовать последовательности нуклеотидов, которые отличаются от собственных генов вируса и, как оказалось, захвачены из ДНК клетки-хозяина. Таким образом, для ретровирусов характерна передача генетической информации в направлении РНК ДНК РНК, и они являются природными генетическими векторами. Теперь ясно, почему на их основе удобно создавать искусственные векторы для переноса генов.

5)ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ГЕНОТЕРАПИИ

При упомянутом выше комбинированном  иммунодефиците, связанном с дефектом аденозиндезаминазы, перенос "лечебного" гена производили в Т-лимфоциты крови (1990 год, США) или в стволовые клетки костного мозга (1992 год, Италия; 1993 год, Великобритания-Франция). Извлеченные у больного клетки культивировали в пробирке, при помощи ретровирусного вектора вводили неповрежденный ген аденозиндезаминазы, дефект которого вызвал заболевание, и возвращали клетки больным. С дефектом этого фермента связано 25% случаев всех известных врожденных нарушений иммунных механизмов (иммунодефицитов). Иммунодефициты, связанные с дефектом других ферментов, также, вероятно, можно будет лечить вводя функционально активные копии соответствующих генов.

Еще одна группа наследственных заболеваний, для которой можно  рассчитывать на успешное лечение генами, введенными в стволовые клетки костного мозга, - это так называемые лизосомные болезни накопления, на долю которых приходится около 10% случаев всех генетических дефектов. Известно, что лизосома - органелла эукариотической клетки - содержит 40 ферментов, ответственных за внутриклеточное расщепление различных макромолекул. Мутация гена, кодирующего тот или иной лизосомный фермент, приводит к тому, что нерасщепленный субстрат этого фермента накапливается в лизосомах, что и обусловливает патологию. Клинические испытания возможности переноса "лечебного" гена при помощи ретровирусного вектора в культивируемые клетки костного мозга проводятся для одного из заболеваний этой группы - болезни ГошО, связанной с накоплением липидов и названной по имени описавшего ее ученого.

Похожий прием был использован  для лечения генетического заболевания  под названием "семейная гиперхолестеринемия". Это заболевание приводит к развитию инфаркта в детском возрасте и обусловлено полным отсутствием в клетках печени рецептора, который должен связывать частицу, переносящую холестерин в плазме крови. Для введения гена этого рецептора у больного отсекали около 200-300 г печени, печеночные клетки (гепатоциты) культивировали и подвергали генетическому изменению в лабораторных условиях, а затем вводили больному обратно в печень через кровеносные сосуды.

Введение гена, кодирующего  тот или иной фактор свертывания  крови, может спасать больных, страдающих одной из форм гемофилии. Заболевания  этой группы встречаются достаточно часто: вспомним хотя бы сына последнего русского царя, царевича Алексея, и  его родственников из королевских  семей Европы. В случае этого заболевания  культивировали один из типов клеток кожи - фибробласты, взятые у больного, вводили в них "лечебный" ген  и наблюдали в культуре клеток синтез и секрецию белка - фактора IX, который в норме фибробластами  не производится. При имплантации  этих клеток в кожу пациентов фактор IX должен вырабатываться и попадать в кровоток. Основная проблема при  этом заключается в том, чтобы  пересаженные клетки могли длительное время существовать в организме  больного. Этого пока добиться не удается.