Эпифитная микрофлора зерна

г) с равномерным помутнением среды.

При описании роста микробов на МПБ обращают внимание на:

1) характер помутнения  среды: легкое, среднее, сильное или  отсутствие мути;

2) образование пленки  на поверхности среды: тонкая, толстая, морщинистая, складчатая, слизистая  и т. д.;

3) количество, характер и  цвет осадка: точечный, обильный, зернистый, слизистый, хлопьевидный, серый, бело  – желтый и т. д.;

4) наличие пристеночного кольца: узкое, широкое, тонкое, узловатое, серое, синеватое. Для анаэробов отмечают еще и газообразование [12].

Рост на плотных средах. Рост на плотных средах может иметь вид сплошного наложения или отдельных колоний и быть обильным, слабым или умеренным. Так как колония образуется в результате размножения одной клетки, ее строение зависит от особенностей деления клеток данного вида микроорганизмов. Каждый вид образует на плотных питательных средах колонии, обладающие определенными свойствами. Эти свойства колоний изучают макроскопически и микроскопически. При макроскопическом изучении колоний (невооруженным глазом) чашку просматривают сначала со стороны дна в проходящем свете, а затем со стороны крышки в отраженном свете. При микроскопическом изучении выявляется строение колоний – характер их краев и структура. Край колоний может быть ровным в виде четко выраженной линии и неровным (волнистый, зазубренный, бахромчатый, локонообразный). Структура  колоний может быть гомогенная или аморфная, мелко – и грубозернистая, волокнистая, однородная и неоднородная. Различают поверхностные и глубинные колонии в зависимости от их положения в среде. Наиболее типично видовые признаки выражены у поверхностных колоний. Форму, профиль, блеск и цвет отмечают визуально, край и структуру – при малом увеличении микроскопа. Консистенцию (мягкая, слизистая, тягучая или хрупкая) определяют прикосновением к ее поверхности петлей, размеры – обычной линейкой или окулярным микрометром при малом увеличении микроскопа (колонии точечные – менее 1 мм в диаметре, мелкие – 1 – 2, крупные – более 4 мм).

Характер роста по уколу. Характер роста по уколу указывает на отношение микроба к кислороду воздуха, аэробы растут в виде гвоздя, шляпкой вверх, факультативные анаэробы растут равномерно по всему уколу; анаэробы – в нижней части укола. При выращивании на МПЖ одни виды бактерий (протеолитические) разжижают желатин, другие – не разжижают [12].

 

2.3.4 Окрашивание клеток колоний по Граму

Приготовление окрашенного препарата состоит из следующих этапов: приготовление мазка, его высушивание, фиксация и окраска.

Для приготовления мазка на середину чистого предметного стекла наносят небольшую каплю воды и с помощью бактериальной петли помещают в нее исследуемый материал. Материал равномерно распределяют на стекле таким образом, чтобы образовался тонкий мазок круглой или овальной формы размером 1–2 см2. Затем препарат высушивают либо при комнатной температуре на воздухе, либо в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки. Высушенный мазок подвергают фиксации, вследствие чего он прикрепляется к стеклу (фиксируется), микробы инактивируются и становятся безопасными, возрастает их восприимчивость к окраске [12].

 Проба фиксировалась жаром нагреванием на пламени горелки. После производят окраску мазка. Наиболее пригодными для окраски являются основные и нейтральные анилиновые красители. Окрашенный препарат промывают водой и высушивают. На высушенный мазок наносят каплю иммерсионного масла и микроскопируют, пользуясь иммерсионной системой микроскопа.

Метод окраски по Граму наиболее распространенный способ окраски. Бактерии в зависимости от того, подвергаются они окраске по этому методу или нет, разделяют на две группы: грамположительные (красящиеся по Граму) и грамотрицательные (не красящиеся) Различие в окраске обусловлено разным строением клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Методика окраски по Граму заключается в последовательной обработке фиксированного мазка: окраске генцианвиолетом через фильтровальную бумагу (1–2 мин), обработке раствором Люголя (1 мин), обесцвечивании спиртом (1/2–1 мин), промывании водой, окрашивании фуксином (1–2 мин). Сущность метода состоит в том, что грамположительные бактерии удерживают комплекс краситель – йод и не обесцвечиваются спиртом, грамотрицательные не обладают этим свойством, т. е. обесцвечиваются спиртом (дифференцирующим веществом) и докрашиваются фуксином. В результате грамположительные бактерии приобретают фиолетовый цвет, грамотрицательные – красный [12].

 

2.3.5 Окраска спор

Спорообразование и расположение спор в клетке – видовой признак. Форма спор округлая или овальная. По внешнему виду клетки со спорой различают следующее расположение:

– бацилярное – присутствие споры не меняет внешнего вида клетки;

– клостридиальное – клетка расширена в месте нахождения споры и имеет вид веретена или лимона;

– плектридиальное – спора находится в конце клетки [12].

 Приготовление окрашенного мазка:

1. На фиксированный мазок накладывают кусочек фильтровальной бумаги и хорошо смачивают ее карболовым фуксином Циля;
2. Препарат подогревают, держа высоко над пламенем, до появления паров, но не доводят до кипения. Когда бумажка подсохнет, подливают новую порцию красителя и опять подогревают. Эту процедуру проводят 3 – 4 раза, после чего бумажку выбрасывают;
3. Препарат погружают в стаканчик с 1% – ной серной кислотой на несколько секунд для обесцвечивания вегетативной части клеток;
4. Препарат тщательно промывают;
5. Подкрашивают клетки метиловым синим 1 – 2 мин;
6. Препарат промывают водой, просушивают фильтровальной бумагой и исследуют под микроскопом с иммерсией. Споры окрашиваются в розовый цвет, вегетативная часть клеток – в голубой цвет [12].

 

2.3.6 Определение  микрофлоры зерна

Колонии группируют по культуральным признакам. Из каждой группы колоний готовят препараты, выявляют принадлежность микроорганизмов к роду или семейству и определяют численность микробов каждой группы в процентах от общего количества микроорганизмов.

На основании микробиологического анализа делают заключение о качестве зерна. На основании микробиологического анализа делают заключение о качестве зерна. На свежем доброкачественном зерне преобладают Erwinia herbicola (до 80%), образующая блестящие оранжевые колонии. Встречаются Pseudomonas fluorescens, формирующая желтовато–зеленоватые флуорисцирующие колонии; непигментированные не спорообразующие палочки; дрожжи – блестящие, выпуклые, часто окрашенные в розовые тона колонии. При учете на сусло –агаре с мелом выявляются молочно – кислые бактерии, образующие чечевицеобразные мелкие колонии с зонами растворения мела.  На несвежем зерне, хранящимся при повышенной влажности, Erwinia herbicola, Pseudomonas fluorescens не выявляются. Обнаруживаются микрококки,  образующие мелкие белые блестящие плоские колонии; спорообразующие палочки; актиномицеты, а также не спорообразующие палочки. При учете на сусло– агаре выявляется значительное количество грибов, главным образом относящихся к роду Penicillium, а также Aspergillus.

 

2.4 Определение фитотоксической активности грибов

Проростки кукурузы являются наиболее пригодными для первичного отбора грибов – продуцентов, фитотоксинов благодаря значительной скорости прорастания и роста (за сутки прирост достигает 5 см) и четкой зависимости роста от наличия в культуральной жидкости фитотоксинов. В работе используют  проростки кукурузы с длинной корней 1–2 см (рис. 2.1).

 

Рисунок 2.1

Проростки кукурузы как объект исследования фитотоксичности поверхностной микрофлоры зерна

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Пред определением фитотоксичности нужно сделать смыв с исследуемых зерен. Кончики корней (точку роста и меристематическую зону) проростков кукурузы помещают на 1 ч в культуральную жидкость – смывы с поверхности зерен изучаемых культур растений (рис. 2.2). Контрольные проростки помещают в воду и стерильную питательную среду.

 

Рисунок 2.2

Проростки кукурузы в смывах эпифитной микрофлоры зерна

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

После этого проростки раскладывают в чашки Петри на влажную фильтровальную бумагу (рис. 2.1), чашки помещают в термостат (25–26 0С).

Через 24 ч культивирования измеряют длину корней (рис. 2.4) в опыте и контроле.

 

 

 

 

Рисунок 2.4

Суточная экспозиция проростков кукурузы в смывах исследуемых плодов зерновых культур.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 Зная длину корней до и после культивирования в смывах поверхностной микрофлоры зерен рассчитывают фитотоксическую активность корней (%) по формуле:

   , где

ДХ– средняя длина корней проростков через 24 ч в опыте (мм);

ДК– средняя длина корней проростков через 24 ч в контроле (мм);

ДН– начальная длина корней проростков (мм) [9].

 

Выводы

Таким образом, для изучения многообразия эпифитных микроорганизмов зерна (овса, пшеницы, ячменя), их влияния на показатели прорастания семян злаковых культур, фитотоксичности к высшим растениям (на примере кукурузы) мы  использовали следующие методы: метод лабораторного эксперимента, метод определения токсичности культуральной жидкости с поверхности зерна, метод микробиологического культивирования и микроскопирования.

 

 

 

 

 

ГЛАВА 3

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Характеристика  параметров всхожести и прорастания  зерна

Всхожестью семян называется способность их давать нормальные проростки при оптимальных условиях проращивания за определенный срок. Выражают всхожесть (в процентах) отношением нормально проросших семян к общему числу семян, взятых для проращивания. Одновременно со всхожестью определяют и энергию прорастания семян. Энергия прорастания – это процент нормально проросших семян за определенный срок. При этом анализ семян считается правильным, если между результатами всех проб при всхожести 95% и выше допустимые отклонения не превышают ±2%, при всхожести 92 – 94% не выше ± 5%.

В чашках Петри проращивались пробы для определения энергии прорастания, энергии всхожести и степени заражения плесневыми грибами. Из каждой культуры отбирались 4 пробы по 100 зерен (овса, пшеницы, ячменя). Энергия прорастания определялась на 3 сутки, а энергия всхожести на 7 сутки. Данные обрабатывались в соответствии с ГОСТом 12038 – 84 «Определение всхожести семян». Результаты представлены на рисунке 3.1

Рисунок 3.1

Энергия всхожести и прорастания

 

Самой высокой энергией прорастания и всхожести обладает овёс (74,2% и 56,8% соответственно). Самой низкой – ячмень (1,2 % и 5,2 %). (Рисунок 3.1) Из этого следует, что все 3 культуры прорастут при высадке. Но качество и количество урожая будет зависеть и от микроорганизмов культур.

 

3.2 Эпифитная микрофлора  зерна

Микрофлора зерновых масс состоит из микроорганизмов, населяющих растения при их жизни: эпифитных, свойственных каждому роду и виду растений; паразитирующих на растениях; случайно попадающих на растения (с пылью, брызгами дождя и т. д.) и некоторое время сохраняющих свою жизнеспособность, а также из микроорганизмов, попадающих в зерновую массу в период уборки урожая и особенно при обмолоте, т. е. во время образования зерновой массы. На нормальных созревших здоровых зернах и семенах практически вся микрофлора размещается на поверхности. В процессе хранения зерна эпифитные микроорганизмы постепенно исчезают согласно литературным данным, появляются грамположительные бактерии Bacillus и Micrococcus, а также мицелиальные грибы родов Mucor, Rhizopus, Aspergillus, Penicillium, Helminthosporium, Cochliobosus, Alternaria [7,17].

На рисунке 3.2 представлена микрофлора анализируемых объектов исследования.

Рисунок 3.2

Эпифитная микрофлора зерна

Зерновая микрофлора обладает свойством сохраняться длительное время даже в условиях, исключающих ее активное развитие. При этом численность микроорганизмов постепенно уменьшается, изменяется ее видовой состав.

В анализируемых пробах были обнаружены следующие микроорганизмы: Fusarium, Aspergillus, Penicillum, Mycor, Aсromonium. Как видно из диаграммы 3.1 во всем анализируемом растительном сырье преобладает  Aspergillus (32%), 22% составляет Fusarium, Aсromonium (16%), Mycor (15%), Pennicillum  только 6%. Данные виды являются грибами, из чего можно сделать вывод, что зерно хранилось при повышенной влажности. Преобладающие виды грибов являются токсинообразующими, что отрицательно скажется не только на урожае в целом, но и на животных и человеке.

Из    каждой    группы    колоний     готовили препараты, выявляли принадлежность микроорганизмов к роду и определяли численность каждой группы в процентах в зависимости от культуры (рисунок 3.3).

 

 

 

 

Рисунок 3.3

Соотношение поверхностной микрофлоры зерна в зависимости от культуры растений

Как видно из диаграммы рисунка 3.2 в каждом из исследуемых образцов зерна присутствуют многообразие видов микроорганизмов. Меньше всего микроорганизмов имеется на овсе, а наибольшее количество присутствует на зерне ячменя. На овсе преобладает–  Mycor (5шт.), Aspergillus (3шт.), Pennicillum (2шт), Fusarium и Aсromonium- не присутствуют. На пшенице присутствуют в преобладающем количестве преобладает– Mycor (11шт.), Fusarium (9шт), Pennicillum (4 шт), Aspergillus и Aсromonium отсутствуют . На ячмене в большом количестве имеется – Aspergillus (31шт), Aсromonium (18 шт) , Fusarium (15шт), Pennicillum (2шт), не присутствует только Mycor. Наличие  Fusarium в ячмене и пшенице говорит о том, что  зерно  заражено фузариозом и, соответственно, будет содержать на поверхности токсины.