Методы исследования белков и а-т

Методы исследования белков и а-т

Этапы исследования структуры  белка: 
1).Выделение белка из смеси в чистом виде. 
2).Определение N-концевой аминокислоты. 
3).Определение С-концевой аминокислоты. 
4).Определение аминокислотной последовательности.

 
Методы разделения смеси белков 
1).Диализ (метод мембранных сил). 
Для этого используют полуроницаемые мембраны (целлофан, целлюлоза), диаметр пор которых варьирует в широких пределах. 
2).Гель-хроматография. 
Используеься гель с порами. Белки с маленьким размером заходят в поры, и скорость их прохождения больше. 
3).Аффинная хроматография. 
Основана на высоком сродстве белков к специфическим группам и молекулам. Колонка для аффинной хроматографии заполняется твёрдым носителем, поверхность которого содержит вещества, способные специфически связываться с анализируемыми белками (например белок лектин связывается с глюкозой). 
4).Ионно-обменная хроматография. 
Каждый белок имеет определённый заряд - положительный или отрицательный в определённом рН. Это свойство и лежит в основе ионной хроматографии. Для этого используют целлюлозу, которая заряжена либо отрицательно (катионный обменник) либо положительно (анионный обменник). Белки, которые имеют противоположный заряд по отношению к целлюлозе, сохраняются при прохождении раствора белков через колонку. Потом их отсоединяют с помощью элюентов. 
5).Адсорбционная хроматография. 
Разделение компонентов смеси (образца) основана на их различной сорбируемости на твёрдых адсорбентов. В качестве адсорбентов используют: 
-активированный древесный уголь; 
-гель фосфата кальция; 
-оксид аллюминия; 
-оксид кремния; 
6).Распределительная хроматография. 
Твёрдый носитель играет роль опоры для передвигающего с разной скоростью белка. Носители - силикагель, крахмал, плёнки. 
7).Ультрацентрифугирование. 
8).Электрофорез ( смотри методичку А.Д.Тагановича "Нуклеопротеины"). 
9).Изоэлектрофокусирование. 
Основано на проведение электрофореза в средах с градиентом рН. При этом точное месторасположение на колонке каждого белка из смеси определяется значением его изоэлектрической точки.

Определение N-концевой аминокислоты 
Перед тем, как определять последовательность аминокислот в белке, необходимо удалить дисульфидные связи внутри пептидов и между другими пептидами. Для этого используют 2-меркаптоэтанол или дитиотреитол. Чтобы предотвратить обратное образование дисульфидных связей, белок надо обработать йодацетатной кислотой (алкилирует свободные сульфогидрильные радикалы). Методы: 
1).Метод Сенжера. Для этого используют 1-фтор-2,4-динитробензол (ФДНБ), который взаимодействует с N-концевой аминокислотой в щелочных условиях. Такая аминокислота может быть отщеплена от белка и идентифицирована, т.к. имеет жёлтый цвет. Затем проводят электрофорез и сравнивают искомую аминокислоту со стандартами. 
2).Даксил-хлорид. Как и ФДНБ, даксил-хлорид взаимодействует с N-концевой аминокислотой в щелочных условиях. Анализ как по методу Сенжера, только даксилированные аминокислоты определяют посредством флюоресценции. 
3).Метод деградации Эдмана. При использовании этого метода аминокислотная последовательность в белке остаётся невредимой. Это имеет преимущество перед предыдующими методами, т.к. можно определить всю последовательность аминокислот в белке. При этом методе используют фенилизотиоционат (ФИТЦ).

 
Определение С-концевой аминокислоты 
1).Метод Акабори. Используется гидразин. Он расщепляет пептидные связи , не нарушая последовательность а-т в пептиде. Эту а-ту определяют с помощью ФДНБ. 
2).Ферментативные методы, Используются карбоксипептидазы, которые осуществляют разрыв пептидной связи с того конца пептида, где содержится свободная СООН-группа. Это приводит к освобождению С-концевой аминокислоты, природа которой может быть идентифицирована методом хроматографии.

 
Определение аминокислотной последовательности 
Для этого сначала проводят избирательный (частичный) (химический или ферментативный) гидролиз пептида на олигопептиды, последовательность а-т в которых может быть точно определена. 
Химические методы избирательного гидролиза основаны на применении таких химических реактивов, которые вызывают селективный распад пептидных связей, образованных определёнными а-тами, оставляя незатронутыми другие связи: 
-бромциан (по остаткам метионина) 
-гидроксиамин (меду аспаргиновой кислотой и глицином) 
-N-бромсукцинамид (по остаткам триптофана). 
Ферментативные методы - основаны на избирательном действии протеолитических ферментов, расщепляющих пептидные связи, образованные определёнными а-тами: 
-пепсин (фен-тир-глу) 
-химотрипсин (три-тир-фен) 
-папаин, субтилизин и др. 
Метод пептидных карт (метод отпечатков пальцев, метод Ингрена). 
Используется при определении сходства и различий гомологических белков по первичной структуре. 
Гомологические белки - это белки, которые выполняют одну и туже функцию, но различаются по структуре (норма и патология, локализованные в разных органах). 
Этапы: 
-оба белка (например от здорового и больного человека) расщепляют на пептиды с помощью пепсина, трипсина. 
-затем смесь пептидов наносят в виде пятна на угол листа фильтровальной бумаги. 
-проводят электрофорез в горизонтальном направлении и хроматографию в вертикальном. 
-полученные карты (их две) сравнивают. 
Этим методом определяется серповидно-клеточная анемия (глу - вал).