Методы качественного и количественного определения некоторых антибактериальных химиотерапевтических препаратов ряда пенициллинов и ни

Как и другие вещества кислого характера, производные  нитрофурана образуют окрашенные нерастворимые комплексные соединения с солями тяжелых металлов (AgNO₃, CuSO₄, CoCl₂ и др.).

Гидролитическое расщепление. При жестком взаимодействии растворами щелочей у всех растворимых препаратов происходит разрыв фуранового цикла. Другие превращения индивидуальны для каждого препарата в зависимости от характера заместителя. Так, при нагревании фурацилина в растворе щелочи образуется аммиак, гидразин и карбонат натрия.

Окислительно-восстановительные свойства. В результате щелочного гидролиза препаратов группы нитрофурана образуется альдегид, с которым можно провести характерные окислительно-восстановительные реакции («серебряного зеркала», Фелинга).

Продуктом гидролиза фурацилина является также гидразин – энергичный восстановитель. Восстановительные свойства фурацилина используются для его количественного определения [5].

Количественное  определение фурацилина ГФ рекомендует  выполнять йодометрическим методом, основанном на окислении препарата  йодом в щелочной среде (для улучшения растворимости к навеске прибавляют хлорид натрия и смесь подогревают).

Титрованный раствор йода в щелочной среде  образует гипойодид:

I₂ + 2NaOH ® NaI + NaIO + H₂O

После окончания процесса окисления препарата  раствор подкисляют и титруют выделившийся избыток титрованного раствора йода тиосульфатом натрия [6]:

NaIO + NaI + H₂SO₄ ® I₂ + Na₂SO₄ + H₂O

I₂ + 2Na₂S₂O₃ ® 2NaI + Na₂S₄O₆

2. Кислотно-основные свойства ампициллина и его металлокомплексы

На сегодняшний  день наиболее часто используемыми антимикробными препаратами являются пенициллины. В медицинской практике применяются десятки препаратов этого типа, синтезируются новые антибиотики, более эффективные и химически устойчивые, менее токсичные.

Молекулы пенициллинов могут содержать различные функциональные группы, имеющие выраженный кислотный (карбоксильная, сульфоновая) или основный характер (аминная, аминотиазольная), а также группы слабо участвующие в кислотно-основных взаимодействиях (фенольная, амидная). В зависимости от комбинации функциональных групп антибиотик может проявлять свойства кислоты, основания, либо амфотерного соединения.

Большое значение имеет точное определение констант кислотно-основных равновесий, характерных для данного  вещества. Это позволяет определить форму существования антибиотика в растворе при различных значениях рН (недиссоциированная молекула, катион, анион, цвиттер-ион), а, следовательно, форму его существования в тех или иных биологических жидкостях, прежде всего в крови, и возможность его взаимодействия с компонентами этих жидкостей и другими лекарственными веществами. По типу участия в кислотно-основных взаимодействия пенициллины можно разделить на три типа: 1) антибиотики кислотного типа; 2) амфотерные антибиотики с карбоксильными и аминными группами (антибиотики аминокислотного типа); 3) амфотерные антибиотики с карбоксильными и аминотиазольными группами.

Антибиотики 2-го типа, как  правило, содержат одну карбоксильную  и одну аминогруппу. К этой группе относиться ампициллин.

Рис. 11. Структурная формула ампициллина

В основе строения ампициллина лежит 6-АПК, включающая два конденсированных гетероцикла  – азетидиновый (β-лактамный) и тиазолидиновый, которые имеют общий (узловой) атом азота. В положении 3 находится карбоксильная группа, при С-2 – две метильные группы, а в положении 6 – амидная группа [11].

В работе [12] потенциометрическим методом исследованы кислотно-основные свойства бензилпенициллина, карбенициллина и ампициллина при 20°С и ионной силе 0,1 (KCl). Кривые рН-метрического титрования растворов антибиотиков имеют вид:

Рис.11. Кривые рН-метрического титрования растворов натриевых солей банзилпенициллина (1), карбенициллина (2), ампициллина (3) 0,05 М. раствором НСl [12].

Рассчитаны  диаграммы распределения ионных и молекулярных форм этих веществ в зависимости от рН раствора.

Рис.12. Диаграмма распределения форм ампициллина в водном растворе в зависимости от рН. 1 – H²Amp⁺, 2 – HAmp^±, 3 – Amp^– [12].

По структуре  молекулы и кислотно-основным свойствам ампициллин близок к аминокислотам и дипептидам, может существовать в виде аниона (в щелочной среде), цвиттер-иона (в нейтральной среде) или катиона в кислой среде, которые находятся в равновесии.

Кривая ампициллина  имеет две буферные области (в  щелочной и в кислой средах), следовательно, для него характерны две константы кислотной диссоциации. К₁ соответствует диссоциации катиона с отщеплением протона от карбоксильной группы и образованием цвиттер-иона с отщеплением протона, координированного аминогруппой, и образованием аниона:

 

К₂ соответствует диссоциации цвиттер-иона с отщеплением протона, координированного аминогруппой, и образованием аниона:

Экспериментальные значения констант приведены в таблице 4 (см. Приложение). Видно, что кислотные свойства карбоксильных групп у β-лактамных антибиотиков выражены сильнее, чем у алифатических карбоновых кислот – уксусной, пропионовой и т.д., для которых рК_а > 4,5. Это объясняется отрицательным индуктивным эффектом пенамгруппы. Значения К₂(NH⁺) – больше чем у аминокислот на два порядка (для глицина рКа 9,84, для аланина рК_а 9,80, для ампициллина – только 7,22) и близки к соответствующим константам дипептидов. Так для GlyGly и GlyAla рКа при 25ºС и I = 0,1 равны 8,09 и 8,19 соответственно. Очевидно, это является следствием отрицательного индуктивного эффекта аминогруппы в дипептидах и антибиотиках [13].

Пенициллины применяются  часто и в относительно больших  дозах. Вследствие этого исследование их взаимодействия с другими веществами представляет значительный теоретический и практический интерес. Согласно литературным данным многие антибиотики способны образовывать устойчивые комплексы с катионами металлов. Образование металлокомплексов оказывает влияние на антимикробную активность, токсичность, фармакокинетику, устойчивость к гидролизу и другие биологические и химические свойства антибиотиков [21].

Амфотерные  антибиотики с карбоксильными и аминными группами по лигандным свойствам близи к дипептидам. В работе [22] методом ЯМР показано, что анионы ампициллина (Amp^–) координируются ионами Cu²⁺ также как и анионы дипептидов: через аминогруппу и атом кислорода амидной группы (комплекс 1). Была отмечена высокая устойчивость образующегося комплекса ампициллина и сильное каталитическое действие Cu(II) на гидролиз антибиотика. Этот же эффект был отмечен и в работах по исследованию взаимодействия Amp^– c Co(II), Ni(II), Cu(II), Zn(II), Cd(II) методами вольтамперометрии [22] и полярографии [24]. Однако устойчивость этих комплексов в этих работах не была определена.

Первые количественные данные по устойчивости комплексов ампициллина  были получены в работе [15]. Найденные константы приведены в таблице 5 (см. Приложение). Можно отметить явно заниженное значение константы образования комплекса CuAmp⁺. В дальнейшем взаимодействие Amp^- с Cu²⁺ исследовано в работах [25, 26] методами полярографии, потенциометрии, УФ/вид и ИК-спектроскопии. Обнаружено, что в водном растворе образуются растворимые комплексы CuAmp⁺ и Сu(Amp)₃^– и малорастворимые Cu(Amp)₂. Осадок Cu(Amp)₂  растворяется в кислой (рН< 3) и щелочной (рН> 10) среде. Спектральные характеристики: λ_max (CuAmp) = 735 нм, λ_max (CuAmp₃) = 590 нм. Для Cu(Amp)₂ найдено ПР = 2,7·10^–11. Предполагается координация Amp^– через аминогруппу и карбоксилатную группу (комплекс 2). Образующиеся медные комплексы ампициллина гидролизуются до комплексов пенициллоиновой кислоты. В работе [27] потенциометрическим методом исследовано комплексообразование Сu²⁺ c анионами Amp^–, Cpx^– (цефалексина) и Axn^– (амоксициллина), обнаружены комплексы CuL⁺ и Cu(OH)L, определены их константы образования.

Комплекс 1

Комплексообразование ионов UO₂²⁺ с Amp^–, Cpx^– и анионами цефрадила (Crd^–) исследовано в работе [28] методами потенциометрического титрования. Определены константы образования средних и гидроксокомплексов. Путем охлаждения растворов, содержащих эквимолярные количества антибиотиков и UO₂(NO₃)₂, получены твердые комплексы UO₂LNO₃·H₂O, которые исследованы методами элементного анализа и ИК-спектроскопии. Сделан вывод о координации анионов антибиотиков через аминогруппу и атом кислорода амидной группы (комплекс 1).

Комплекс 2

В работе [17] исследовано взаимодействие ионов Co²⁺, Ni²⁺, с Amp^– и органическими основаниями (В): гуанином, аденином, урацилом, тимином, цитозином. Обнаружены комплексы MAmp и MAmpB. Установлено, что при рН > 8 комплексы диссоциируют по кислотному механизму. Обсуждено строение комплексов. Авторы предполагают, что ионы металлов координируют Amp^– через аминогруппу и атом кислорода амидной группы (комплекс 1). В дальнейшем при увеличении рН возможно изменение структуры комплекса, диссоциация амидного протона, координации амидного азота и координации атома S (комплекс 3). Координация атома серы объясняется изменением УФ/вид спектра. Однако координация тиоэфирной серы характерна для Cu(I), а не для Cu(II) [29]. Поэтому этот вывод сомнителен. Кроме того, известно, что Cu(II) катализирует гидролиз Amp^- c разрывом бета-лактамного цикла. В данной работе этот факт не учитывается и не обсуждается. В работе [30] авторами исследованы тройные комплексы «катион металла – анион Amp^– – анион аминокислоты». Найденные значения констант образования тройных комплексов представлены в таблицах 4 и 5. Методами потенциометрии и спектрофотометрии исследовано комплексообразование Amp^– с катионами Zn²⁺, Cd²⁺ [31], Mn²⁺, Co²⁺, Ni²⁺ [32]. Показано, что Ni²⁺ образует комплексы NiAmp⁺ и NiAmp₂, а другие катионы – только MAmp⁺, найдены константы образования комплексов.

В работе [18] изучено взаимодействие Amp^- с Co²⁺, Ni²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, Cd²⁺, Hg²⁺, Pb²⁺, Fe³⁺ потенциометрическим методом при различных температурах (20 – 45°С) на фоне 0,3 моль/л КСl в водно-этанольных растворах. Для Co²⁺, Ni²⁺, Zn²⁺, Cd²⁺, Hg²⁺, Pb²⁺ обнаружены комплексы MAmp, для Cu²⁺ и Fe³⁺ – комплексы MAmp и MAmp₂. Комплексы выделены также в твердом виде и исследованы методами элементного анализа, ИК и УФ/вид спектроскопии, ЯМР ¹³С и ¹Н. Сделан вывод, что в координации участвуют аминогруппа и амидный атом кислорода лиганда (комплекс 1).

Комплекс 1	Комплекс 3

Методами потенциометрии исследовано взаимодействие Amp^–, Axn^– и Cpx^– с катионами Ag⁺ [33], Al³⁺ [34], Nd³⁺ [35], комплексами NiGly⁺ [36] и CoGly⁺ [37] при 20°С на фоне 0,1 моль/л KNO₃. Найденные формы комплексов и константы их образования представлены в таблице 5.

Спектрофотометрическим  методом исследовано взаимодействие NaAmp с Cu(II) в метанольном растворе при 20°С [38]. Обнаружены комплексы, характеризующиеся полосой поглощения 610 нм и имеющие состав СuAmp 
(ε = 88,0 ± 1,4 л∙моль^–1∙см^–1), CuAmp₂ (ε = 126,6 ± 1,7 л∙моль^–1∙см^–1), CuAmp₃ 
(ε = 136,5 ± 2,6 л∙моль^–1∙см^–1).

В работе [39] предложен СФ-метод количественного определения ампициллина, основанный на образовании их комплексов с Cu(II). В нейтральном растворе на фоне 0,2 М CH₃COONa образуются комплексы Cu₂Amp³⁺ зеленой окраски. Полосы поглощения  комплекса Cu₂Amp³⁺ – 640 нм (ε = 189 л∙моль^–1∙см^–1).

Спектрофотометрический  метод определения Amp, основанный на образовании в ацетатном буферном растворе (рН около 5) тройных комплексов Cu(II) с Amp и 1,10-фенантролином состава Cu(Phen)₂Amp, описан в работе [40]. Комплексы имеют желтую окраску (λ_max = 446 нм), развитие которой происходит в течение 40 мин при комнатной температуре и в течение 10 мин при 40°С.

В работе [41] исследованы димерные твердые комплексы Amp^- c Co²⁺, Ni²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, Cd²⁺ состава (MLCl)₂∙2H₂O, которые были получены в виде осадков в результате взаимодействия хлоридов металлов с NaAmp в мольном соотношении 1:1 в водном растворе в течение 1 ч. Комплексы исследованы методом элементного анализа, ИК и ЭПР-спектроскопии, записаны Уф/вид спектры их этанольных растворов. Для комплексов Zn(II) и Cd(II) получены также спектры ЯМР ¹³С и ¹Н. На основании данных сделан вывод о димерной структуре комплексов, в которых лиганды координированы через аминные, амидные (атом О), бета-лактамные (атом О) и карбоксильные группы (комплекс 4).

Комплекс 4

В работе [42] синтезированы и исследованы комплексы Amp^– c оловоограническими катионами: R₂SnClAmp∙H₂O, R₃SnClAmpNa∙H₂O и R₂SnAmp₂∙2H₂O, где R – Me, Bu, Ph. Вода не входит в координационную сферу олова. Amp^- ведет себя в комплексах R₂SnClAmp∙H₂O и R₃SnClAmpNa∙H₂O как бидентатный лиганд, координированный через атом кислорода бета-лактамной группы и атом кислорода карбоксилатной группы. В комплексах R₂SnAmp₂∙2H₂O – как монодентатный лиганд, координированный через атом килорода бета-лактамной группы. В комплексах R₂SnClAmp∙H₂O и R₃SnClAmpNa∙H₂O атом олова находится в тригонально-бипирамидальном окружении. В комплексах R₂SnAmp₂∙2H₂O наблюдается конфигурация искаженного октаэдра.

В работе [43] предложен СФ-метод количественного определения ампициллина, основанный на образовании комплекса с Cu(II). Реакция происходит в щелочной (аммиачной) среде с дальнейшим подкислением раствора. Комплексы имеют желтую окраску (λ_max = 395 нм), развитие которой происходит в течение 20 – 25 мин при комнатной температуре

В целом антибиотики  аминокислотного типа способны к комплексообразованию. С катионами p- и d-элементов они образуют высокоустойчивые ацидокомплексы. Комплексы с катионами s- и f-элементов существенно менее устойчивы. Данные о структуре комплексов различны и в некоторых случаях противоречивы. Во многих работах делается вывод о том, что анионы этих антибиотиков координируются также как и анионы дипептидов – через аминную и амидную (атом О) группы. В то же время активное каталитической действие катионов металлов, прежде всего Cu²⁺ и Hg²⁺, на гидролиз антибиотиков свидетельствует в пользу координации и бета-лактомной группы. Одновременная координация аминной, амидной и бета-лактомной групп невозможна. В этом контексте для комплексов состава ML наиболее реалистично выглядит структура комплексов 4. Легкость образования смешаннолигандных и гидроксокомплексов свидетельствует о незаполненности координационной сферы катионов-комплексообразователей. Таким образом, для комплексов антибиотиков аминокислотного типа в водном растворе наиболее вероятна структура, в которой лиганд координирован через аминную, бета-лактамную и карбоксильную группы. При этом бета-лактамная группа может быть координирована либо через атом О (стуктура1), либо через атом N (структура 2) в зависимости от химической природы катиона-комплексообразователя.