Микробиология

ВВЕДЕНИЕ

 

        Микробиология  от греч. микрос - малый, биос - жизнь,  логос - наука – наука о малых  живых существах называемых ранее  микробами, сейчас - микроорганизмами.

          Микробиология изучает морфологию (внешнее строение), цитологию (внутриклеточное строение), экологию (связь микроорганизма со средой обитания), генетику (закономерности передачи наследственной информации в процессе размножения), физиологию (жизнедеятельность) и биохимию (химический состав, превращение веществ и энергии) микроорганизмов.

         Объектами изучения микробиологии  является большая группа разнообразных  живых существ: бактерии, микроскопические  водоросли, грибы, одноклеточные  животные типа Простейшие. Общим  признаком этих организмов является  их малый размер (до 1мм в диаметре).

          Несмотря  на разнообразие организмов имеются  общие методы их исследования. Одним из таких методов является  микроскопия – приготовление  и изучение под микроскопом  временных и постоянных препаратов, полученных из микроорганизмов,  тканей и клеток высших растений и животных.

МИКРОСКОПИЯ

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

 

          Основным оборудованием микроскопии  является микроскоп.

         Световой  микроскоп

 

          В световом микроскопе для  получения увеличенного изображения очень мелких объектов используется увеличительная способность выпуклых линз, расположенных в объективах и окулярах. В микроскопе различают механическую и оптическую часть. Оптическая часть – объектив, окуляры, бинокулярная насадка, осветительный прибор и конденсор. В механической части различают штатив (ножка и колонка), тубус, револьверное устройство, предметный столик, макро- и микрометрические винты (см. рис.1).

         Микроскоп - дорогой прибор, поэтому необходимо обращаться с ним осторожно, соблюдая следующие правила:

         1. Храните микроскоп в ящике (или под колпаком), чтобы предохранить его от пыли.

         2. Вынимайте его из ящика двумя руками и ставьте на место мягко, чтобы избежать сотрясения.

          3. Линзы должны быть чистыми, для этого их необходимо протирать кусочком ткани.

          4. Микроскоп всегда необходимо фокусировать, перемещая тубус вверх от препарата. В противном случае очень легко повредить препарат.

          5. Держите открытыми оба глаза и смотрите ими одновременно.

 

 

 

 

 

          I - окуляры;     2 - бинокулярная насадка;      3 - револьверное устройство;       4 - объектив;

5 - предметный столик;    6 - конденсор;   7 - корпус коллекторной  линзы;    8 - патрон с лампой;  

9 - шарнир; 10 - рукоятка перемещения  кронштейна конденсора; II – рукоятка тонкой фокусировки;   12 -   рукоятка грубой фокусировки;    13 - тубусодержатель;    14 - выключатель;

15 - источник электропитания; 16 - гнездо  для подключения штекера источника  электропитания; 17 - штекер.

Рис. 1 Устройство микроскопа с бинокулярной насадкой,

встроенным в основание  осветителем с галогенной лампой.

 

 Настройка микроскопа для работы при малом увеличении

 

          1. Поставьте микроскоп на стол и сядьте в удобной позе. Исследуемый объект на предметном столике микроскопа должен быть освещен. Для этого пользуются специальным осветителем, светом из окна или от настольной лампы. Свет направляют снизу вверх через отверстие в предметном столике.

          2. С помощью винта грубой настройки поднимите вверх тубус микроскопа и поворачивайте револьверную головку до тех пор, пока объектив с малым увеличением (х 10 или 16 мм) не попадет в паз тубуса (при этом раздается щелчок).

           3. Положите препарат, который вы собираетесь рассматривать, на предметный столик микроскопа так, чтобы исследуемый материал находился над серединой отверстия в предметном столике. Закрепите предметное стекло с помощью фиксаторов.

           4. Глядя на предметный столик и препарат сбоку, опускайте тубус с помощью винта грубой настройки до тех пор, пока объектив с малым увеличением не окажется примерно в 5 мм от препарата.

            5. Глядя в микроскоп, поворачивайте винт грубой настройки до тех пор, пока объект не попадет в фокус.

            6. Для перемещения препарата в  поле зрения пользуйтесь винтами фиксаторов на предметном столике.

 

Настройка микроскопа для работы при большом  увеличении

 

            1.   Настроить микроскоп как  для работы при малом увеличении.

            2. При работе с объективом большого увеличения используют искусственный свет от настольной лампы или специального осветителя для микроскопа с матовой лампочкой. При работе с лампой накаливания необходимо между ней и микроскопом поместить лист бумаги.

            3. Не убирая препарата с предметного столика, выведете из хода лучей откидную линзу конденсора. Поднимите конденсор так, чтобы расстояние между ним и предметным столиком было не более 5 мм. Теперь наводите фокус конденсора до тех пор, пока изображение лампы не наложится точно на препарат. Поместите конденсор несколько вне фокуса так, чтобы изображение лампы исчезло. Теперь освещение должно быть оптимальным. В конденсор вмонтирована ирисовая апертурная диафрагма. Ею регулируют величину отверстия, через которое проходит свет. Эта диафрагма должна быть открыта полностью.

              4. Поворачивайте револьверную головку до тех пор, пока объектив большого увеличения (х 40) не попадет в паз. При установленном фокусе на малом увеличении, объектив большого увеличения автоматически установится приблизительно в фокусе. Фокусирование всегда производите движением объектива вверх с помощью винта тонкой настройки.

 

           Внимание! Если при движении объектива с линзами большого увеличения фокус не устанавливается, сделайте следующее: глядя на предметный столик сбоку, опускайте тубус микроскопа до тех пор, пока линза почти не коснется препарата. Следите за отражением линзы объектива на препарате и добивайтесь того, чтобы линза почти коснулась своего отражения. Глядя в микроскоп и поворачивая винт тонкой настройки, медленно поднимайте объектив до тех пор, пока изображение не попадет в фокус.

 

Иммерсия

 

            Для того чтобы получить более  сильное увеличение, чем при работе  с обычным объективом большого  увеличения, необходимо использовать  иммерсионную линзу. При пользовании сухим объективом между объективом и рассматриваемым предметом находится воздух, а при пользовании иммерсионным объективом последний погружается в каплю жидкости, которую предварительно наносят на предметное стекло. Иммерсионные объективы также называются погружными и, в зависимости от используемой иммерсионной жидкости маркируются МИ (масляная иммерсия) – чёрное кольцо на объективе или ВИ (водная иммерсия) – белое кольцо на объективе. Жидкость должна иметь тот же коэффициент преломления, что и сама линза. При масляной иммерсии используется кедровое масло.

 

 

 

 

 

Рис. 2. Ход лучей в  иммерсионной и сухой системе.

 

 

 

 

 

 

         1.  Настроить микроскоп как  для работы при малом увеличении 

         2. Капните каплю кедрового масла на покровное стекло непосредственно над исследуемым объектом.

         3. Увеличьте освещение, открыв  диафрагму конденсора.

         4. Сфокусируйте изображение как при работе с большим увеличением. Вместо объектива с линзой большого увеличения установите объектив с масляно-иммерсионной линзой так, чтобы его передняя линза погрузилась в каплю масла.

Помните, что фокусная плоскость линзы находится всего в 1 мм от поверхности покровного стекла.

         5. Для использования полной силы  иммерсионного объектива каплю  иммерсионного масла или воды наносят на поверхность верхней линзы конденсора, поставленного в самое верхнее положение.

         6. Закончив работу, сотрите с линзы масло сначала фильтровальной бумагой затем мягкой тряпочкой.

 

 

Увеличение

 

Общее увеличение микроскопа определяется как

увеличение объектива  Х увеличение окуляра Х увеличение насадки

Таблица 1   Увеличение микроскопа

 

Линза объектива	Линза окуляра	Насадка	Увеличение объекта
10	10	1,5	150
40			600
100			1500

 

           Качество микроскопа определяется не только степенью увеличения объекта но и разрешающей способностью микроскопа, т.е. наименьшим расстоянием между двумя точками, изображение которых отчётливо видно в микроскоп. Разрешающая способность светового микроскопа ограничивается длинной световой волны. Объект мельче ½ длинны световой волны нельзя увидеть даже в самые лучшие световые микроскопы. Средняя длина волны видимого света составляет примерно 550 нм, поэтому в конце XIX в. могли получить разрешение примерно в 200 нм. Незначительное увеличение разрешающей способности было достигнуто благодаря использованию специально сконструированного микроскопа с ультрафиолетовым светом (длина волны которого составляет 250 нм), обеспечивающим разрешение примерно в 100 нм. Однако многие клеточные структуры имеют меньший размер.

Для изучения столь мелких объектов  в 1932 г. был сконструирован электронный микроскоп.

 

 

          Электронный микроскоп

 

          Вместо светового излучения в  электронном микроскопе используют  пучок электронов, у которых длина волны значительно меньше и, следовательно, с намного большей разрешающей способностью. Длина волны электронов зависит от напряжения, подаваемого для генерации электронного пучка, но практически можно получить разрешение приблизительно в 0,5 нм, т. е. примерно в 400 раз больше, чем в световом микроскопе. Создаваемое увеличение достаточно, чтобы различить крупные молекулы. Лимитирующим фактором в достижении большего увеличения стало (и остается до сих пор) не усиление разрешающей способности микроскопа, а методы подготовки материала для исследования.

           В сущности принцип действия  электронного микроскопа такой же, как и светового микроскопа, в котором пучок световых лучей направляется линзой конденсора через образец, а полученное изображение затем увеличивается с помощью линз. В табл. 2 суммированы некоторые сходства и различия между этими микроскопами.

 

Таблица 2  Сравнение светового  и электронного микроскопов

 

Параметры	Трансмиссионный электронный микроскоп	Световой микроскоп
Источник излучения	Электроны	Свет
Длина волны	Например, 0,005 нм при 50 кВ	400-700 нм
Максимальное полезное увеличение	х 250000 (на экране)	х 1500
Максимальное разрешение: Линзы	0,5 нм Электромагниты	200-500 нм Стеклянные, кварцевые
Объект	Не живой, обезвоженный, маленький или тонкий, удерживается на маленькой  сетке в вакууме	Живой или неживой,   на предметном стекле

 

 

 

 

 

 

 Рис. 3   Современный  транс-

             миссионный электрон-    

             ный   микроскоп 

              (внешний вид)

 

 

 

 

 

         

           

Рис. 4   Траектория пучка электронов в трансмиссионном  электронном        

                          микроскопе.

 

 

         Оператор сидит у пульта управления  лицом к колонне, по которой  проходит пучок электронов. Электронный микроскоп перевернут «вверх дном» по сравнению со световым микроскопом. Здесь источник электронов находится в верхней части колонны, а сам образец – внизу. На вольфрамовую нить накала, находящуюся в верхней части колонны, подается высокое напряжение (например 50000 В), и нить накала излучает поток электронов. Чтобы сфокусировать эти электроны (изменить их траекторию), необходимы уже не стеклянные линзы, а электромагниты. Внутри колонны создается глубокий вакуум, чтобы сократить до минимума рассеивание электронов из-за столкновения с частицами воздуха и происходящее в результате этого нагревание. В трансмиссионном (просвечивающем) электронном микроскопе электроны проходят через образец, поэтому для изучения можно использовать только очень тонкие срезы или частицы, так как электроны легко рассеиваются или поглощаются исследуемым объектом. Части образца с относительно высокой молекулярной массой в наибольшей степени вызывают рассеивание электронов, поэтому при окрашивании образца с целью увеличения контраста используются тяжелые металлы, такие, как свинец или уран. Образец обычно удерживается на маленькой медной сетке (примерно 2 мм в диаметре), которую иногда для большей прочности покрывают тонкой пластмассовой пленкой. Пройдя через образец, электроны собираются и фокусируются добавочными электромагнитными линзами. Электроны невидимы для человеческого глаза, поэтому они направляются или на флуоресцентный экран, который воспроизводит видимое изображение, или же непосредственно на фотопленку, чтобы получить постоянный фотоснимок (электронную микрофотографию).