Микробиология

 

 

            Окрашивание. Краситель наливают на мазок и выдерживают необходимое время. Затем излишки красителя тщательно смывают водою. Препарат сушат фильтровальной бумагой (осторожно!), затем на воздухе.  Окрашенный препарат накрывают покровным стеклом и исследуют под иммерсионным объективом.

             Для окраски микроорганизмов используют в основном анилиновые красители, которые по своим характеристикам делятся на постоянные (окрашивание необратимо) и временные (окрашивание обратимо).

 

 

                       Таблица 4.  Красители, применяемые  для окраски микроорганизмов, 

                                            растительных и животных тканей

 

Краситель	Окончатель-ный цвет	Окрашиваемый материал
Постоянные красители
Анилиновый синий в  лакто-феноле	Синий	Гифы грибов и споры
Борный кармин	Розовый	Ядра; особенно для животного материала.
Фуксин	Розовый	Цитоплазма
	Малиновый	ДНК бактерий, после гидролиза  РНК 1 Н раствором НСl 2 – 3 мин. при 60оС.
Эозин	Розовый	Цитоплазма
Кристаллвиолет	Светло-сиреневый	Жгутики бактерий
	Темно-сиреневый	Цитоплазма бактерий
Судан III	Оранжево-красный	Жировые включения
Раствор Люголя	Фиолетовый	Крахмал
	Тёмно-синий	Гранулёза
	Буро-красный	Гликоген
Краситель Фёльгена	Красный или пурпурный	ДНК; особенно хорошо выявляет хромосомы во время клеточного деления
Гематоксилин	Синий	Ядра; главным образом для срезов животных тканей в сочетании с эозином, окрашивающим цитоплазму; так же для мазков
Краситель Лейшмана	Красно-розовый	Клетки крови
	Синий	Ядра лейкоцитов
Светлый зелё-ный или  проч-ный  зеленый	Зеленый	Цитоплазма и целлюлоза (см. сафранин)
Метиленовый синий	Синий	Ядра (раствор 0,125% метиленового синего в 0,75% NaСl, годен как прижизненный краси-тель)
Сафранин	Красный	Ядра; лигнин и суберин  у растений; используется в основном для срезов растительных тканей в сочетании со светлым зеленым для окрашивания цитоплазмы
Временные красители
Анилина гидрохлорид  или анилина сульфат	Желтый	Лигнин
Раствор йода	Сине-черный	Крахмал
Флороглюцинол + конц. НС1	Красный	Лигнин
Раствор Шульца (хлор-цинк-йод)	Желтый	Лигнин, кутин, суберин, белок
	Синий	Крахмал
	Фиолетовый	Целлюлоза

 

 

           Техника сложного окрашивания ничем не отличается от простого. Стадии окрашивания различными красителями следуют друг за другом согласно методике.

 

            Внимание! Окрашивается только полностью высушенный препарат. При смывании красителя не направляйте струю промывалки непосредственно на мазок, так как вы можете смыть его.

              Выше описанные методики применяются  при изучении объектов под  световым микроскопом. Для электронного  микроскопа техника приготовления препаратов несколько другая.

 

                    Таблица 5. Различия в подготовке  материалов для светового и 

                                                      электронного микроскопов

 

Обработка	Для светового микроскопа	Для электронного микроскопа
Фиксация	См. таблицу 3.	Глутаральдегид или  его смесь с осмиевой кислотой (OsО4).
Обезвожи-вание	Ряд растворов этанола или пропанона  в возрастающей концентрации
Заливка	Парафин	Смола (например, аралдит, эпен) или пластмасса
Приготов-ление срезов	Стальной нож	Алмазный или стеклянный нож.
	Используется микротом	Используется ультратом
	Толщина среза несколько  микрометров	Толщина среза 20-100 нм
Окрашивание	Цветные красители. Отражают видимый свет.	Соединения тяжелых  металлов, Отражают электроны. OsО4 мем-браны в черный цвет.
Изображе-ние	Черно-белое	Обычно цветное

 

Подготовка объектов для электронной  микроскопии

 

            1. Окрашивание ультратонких срезов тяжелыми металлами. Срезы готовятся на ультратоме и окрашиваются соединениями тяжелых металлов нитрат свинца, уранилацетат или осмиевая кислота. Окрашенные участки становятся малопроницаемыми для электронов, и, таким образом, на микрофотографиях они выглядят темными.

            2. Негативное контрастирование. При негативном контрастировании окрашивается фон, тогда как сам образец остается неокрашенным. Этот метод особенно удобен при изучении деталей строения поверхности мелких частиц, таких, как рибосомы, вирусы и фрагменты изолированных органелл и мембран, так как краситель проникает между деталями поверхностного строения.

            3. Напыление. Образец бомбардируется атомами тяжелых металлов, например золотом или платиной, в определенном направлении или под определенным углом. Поверхность образца покрывается слоем металла, непроницаемого для электронов. Закрытые площади, в том числе «тень» за образцом, не покрываются металлом и остаются относительно прозрачными для электронов. Они дают белый цвет (пропускают электроны, которые равнозначны свету). Так как человеческий глаз лучше воспринимает и интерпретирует темные отпечатки, обычно печатают негативы фотографий. Напыление используют также, чтобы выявить структуру поверхности мелких частиц, например вирусов.

            4. Замораживание - скалывание и замораживание - травление. Фрагмент ткани быстро замораживается при очень низкой температуре и затем разламывается с помощью очень острого металлического лезвия. Ткань трескается вдоль слабо соединенных плоскостей, которыми часто являются мембраны (рис. 8). Образец выдерживают на холоде в глубоком вакууме; в этих условиях лед возгоняется, оставляя сколотую поверхность.

           Реплика этой поверхности создается  откладывающимся на ней слоем углерода. На эту реплику из углерода напыляется тяжелый металл, а ткани под репликой разрушаются, как правило, действием сильной кислоты при нормальном атмосферном давлении. Этот метод очень удобен при изучении структуры мембраны. Его преимущество состоит в том, что живые ткани быстро умерщвляются, не подвергаясь химической обработке, которая может повлиять на их структуру.

 

 

Рис. 8.  А. Схематическое  изображение метода замораживания-скалывания.

                          Б. Обнажение клеточных мембран  в процессе скалывания.

 

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

 

           Работа 1  Изучение микрофлоры навозного настоя в раздавленной капле.

           Материалы и оборудование.

           Микроскоп,  предметное и покровное стёкла, микробиологическая петля, спиртовка,  промывалка с дистиллированной  водой.

           Навозный  настой.

           Ход работы.

          Обезжирьте стёкла. Простерилизуйте  бактериологическую петлю в пламени  спиртовки.

           На  середину предметного стекла  стерильной петлёй нанесите каплю  навозного настоя. Затем каплю  накройте покровным стеклом так,  чтобы не было воздушных пузырьков. Препарат исследуйте с помощью сухих объективов при опущенном конденсоре и суженной диафрагме или объективом ВИ-40.

            Под микроскопом на сероватом  фоне обнаруживаются живые микроорганизмы, появляющиеся в разных плоскостях. Зарисуйте наблюдаемые микроорганизмы, обращая внимание на их форму и взаиморасположение клеток.

           Работа 2  Изучение микрофлоры стоячей воды в висячей капле.

           Материалы и оборудование.

           Микроскоп,  предметное стекло с лункой, покровное стекло, микробиологическая петля, спиртовка, промывалка с дистиллированной водой, фильтровальная бумага.

           Вазелин,  вода из стоячего водоёма.

           Ход работы.

          Обезжирьте стёкла. Край лунки  предметного стекла смажьте вазелином. Простерилизуйте бактериологическую петлю в пламени спиртовки.

           На  середину покровного стекла нанесите  каплю воды из стоячего водоёма,  затем переверните покровное  стекло над  центром лунки  предметного стекла так, чтобы  капля свободно висела в углублении, не соприкасаясь с дном и краями. Препарат исследуйте с помощью сухих объективов при опущенном конденсоре и суженной диафрагме.

           Микроскопическая  картина такая же, как и в  раздавленной капле. Рассмотрите  различные типы движения микроорганизмов. Зарисуйте наблюдаемые микроорганизмы, обращая внимание на их форму и взаиморасположение клеток.

 

           Работа 3   Изучение микрофлоры мясного настоя в тёмном поле.

           Материалы и оборудование.

           Микроскоп,  предметное и покровное стёкла, микробиологическая петля, спиртовка, промывалка с дистиллированной водой, темная бумага, ножницы.

           Мясной  настой.

           Ход работы.

          Обезжирьте стёкла. Простерилизуйте  бактериологическую петлю в пламени  спиртовки. Из мясного настоя приготовьте препарат – «раздавленная капля».

           Из  тёмной бумаги вырежьте диск  диаметром 15 мм. Положите его в  центр конденсора и настройте  освещение таким образом, чтобы  препарат был освещён косыми  лучами. Препарат исследуйте с  помощью сухих объективов.

           Под  микроскопом на тёмном фоне  видны светящиеся микроорганизмы. Зарисуйте наблюдаемые микроорганизмы, обращая внимание на их форму  и взаиморасположение клеток.

 

           Работа 4  Изучение микрофлоры навозного настоя в негативном препарате.

           Материалы и оборудование.

           Микроскоп, 2 предметных и покровное стёкла, микробиологическая петля, спиртовка,  промывалка с дистиллированной  водой, стеклянная палочка.

           Навозный  настой, тушь.

           Ход работы.

          Обезжирьте стёкла. Простерилизуйте  бактериологическую петлю в пламени  спиртовки.

          На предметное стекло, ближе к  краю, нанесите каплю туши стеклянной  палочкой и рядом каплю навозного  настоя стерильной петлёй. Сделайте  мазок. Препарат высушите на воздухе, фиксируйте над огнём и накройте покровным стеклом. Рассматрите под иммерсионным объективом МИ-90.

          Под  микроскопом на тёмном фоне  видны неокрашенные микроорганизмы. Зарисуйте наблюдаемые микроорганизмы, обращая внимание на их  форму и взаиморасположение клеток.

 

           Работа 5   Изучение микрофлоры зубного налёта.

           Материалы и оборудование.

           Микроскоп, 2 предметных и покровное стёкла, спиртовка, промывалка с дистиллированной  водой, проволока.

          1% Водный раствор фуксина.

           Ход работы.

          Обезжирьте стёкла. Простерилизуйте  проволоку в пламени спиртовки.  

          Проволокой соберите зубной налет  в достаточном количестве и  нанесите его на край предметного  стекла. Рядом поместите каплю воды и эмульгируйте налёт в воде. Сделайте мазок. Препарат высушите на воздухе, фиксируйте над огнём. Фуксин налейте на мазок и выдержите 1 – 2 мин. Затем излишки красителя тщательно смойте водой. Препарат сушат фильтровальной бумагой (осторожно!), затем на воздухе.  Окрашенный препарат накрывают покровным стеклом и исследуют под иммерсионным объективом МИ-90.

          Под  микроскопом на светлом фоне  видны розово-сиреневые микроорганизмы. Зарисуйте наблюдаемые микроорганизмы, обращая внимание на их  форму и взаиморасположение клеток. На препарате среди прочих бактерий выделяются большая и малая зубная спирохета – Spirochaeta makrodenta и Sp. mikrodenta.

 

 

           По  окончании занятия студент должен  знать:

 

1. Устройство светового микроскопа. Его отличия от электронного.
2. Методики приготовления постоянных и временных препаратов.

                 

                                                          должен уметь:

 

1. Пользоваться световым микроскопом. Настраивать его на малом и большом увеличении
2. Приготовить временные препараты по различным методикам.
3. Выделять на препарате микроорганизмы и зарисовывать их.