Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки

 

 

 

 

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки

 

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) — мультипотентные стволовые клетки, способные дифференцироваться в остеобласты (клетки костной ткани), хондроциты (хрящевые клетки) и адипоциты (жировые клетки).

 

Предшественниками ММСК в  эмбриогенный период развития являются мезенхимальные стволовые клетки (МСК). Они могут быть обнаружены в местах распространения мезенхимы, то есть зародышевой соединительной ткани.

 

Основным источником ММСК является костный мозг. Кроме того, они обнаружены в жировой ткани  и ряде других тканей с хорошим  кровоснабжением. Существует ряд доказательств  того, что естественная тканевая ниша ММСК расположена периваскулярно — вокруг кровеносных сосудов. Кроме того, ММСК были обнаружены в пульпе молочных зубов, амниотической (околоплодной) жидкости, пуповинной крови и вартоновом студне. Эти источники исследуются, но редко применяются на практике. Например, выделение молодых ММСК из вартонова студня представляет собой крайне трудоёмкий процесс, поскольку клетки в нём также располагаются периваскулярно. В 2005—2006 годах специалисты по ММСК официально определили ряд параметров, которым должны соответствовать клетки, чтобы отнести их к популяции ММСК. Были опубликованы статьи, в которых представлен иммунофенотип ММСК и направления ортодоксальной дифференцировки. К ним относится дифференцировка в клетки костной, жировой и хрящевой тканей. Был проведён ряд экспериментов по дифференцировке ММСК в нейроноподобные клетки, но исследователи по-прежнему сомневаются, что полученные нейроны являются функциональными. Эксперименты также проводятся в области дифференцировки ММСК в миоциты — клетки мышечной ткани. Важнейшей и наиболее перспективной областью клинического применения ММСК является котрансплантация совместно с ГСК в целях улучшения приживления образца костного мозга или стволовых клеток пуповинной крови. Многочисленные исследования показали, что ММСК человека могут избегать отторжения при трансплантации, вступать во взаимодействие с дендритными клетками и Т-лимфоцитами и создавать иммуносупрессивную микросреду посредством выработки цитокинов. Было доказано, что иммуномодулирующие функции ММСК человека повышаются, когда их пересаживают в воспалённую среду с повышенным уровнем гамма-интерферона. Другие исследования противоречат этим выводам, что обусловлено гетерогенной природой изолированных МСК и значительными различиями между ними, в зависимости от способа культивирования.

 

МСК могут быть активированы в случае необходимости. Однако эффективность их использования относительно низка. Так, к примеру, повреждение мышц даже при трансплантации МСК заживает очень медленно. В настоящее время проводятся исследования по активации МСК. Ранее проведённые исследования по внутривенной трансплантации МСК показали, что этот способ трансплантации часто приводит к кризу отторжения и сепсису. Сегодня признано, что заболевания периферических тканей, например, воспаление кишечника лучше лечить не трансплантацией, а методами, повышающими локальную концентрацию МСК.

 

 

 

ГЕМОПОЭТИЧЕСКИЕ СТВОЛОВЫЕ  КЛЕТКИ (ГСК)

Итак, ГСК мультипотентны, могут дифференцироваться в клетки различных органов. При работе с ГСК можно использовать аутологичный материал, и как следствие нет риска отторжения при трансплантации реципиента. Они подвергаются криоконсервации, иными словами существует возможность хранения собственных клеток «про запас» с возможностью их использования через длительное время при сохранении всех свойств и возраста клеток на момент забора. Они не дают опухолей in vivo, при введении в организм не вызывают роста новообразований. На сегодняшний день их нельзя культивировать ex vivo, на настоящий момент не выработаны стабильно воспроизводимые методики увеличения количества гемопоэтических клеток в лабораторных условиях.   

 

СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ НЕРВНОЙ  ТКАНИ 

Стволовые клетки нервной  ткани (НСК) расположены в специфических  областях мозга человека и других млекопитающих.

Источником стволовых  клеток нервной ткани является головной мозг как сформировавшегося, так  и развивающегося организма. В результате проведенных экспериментов по трансплантации НСК клетки с донорской меткой были обнаружены в сердце, печени, центральной  нервной системе, кишечнике и  легких, что доказывает их мультипотентность.

Несмотря на то, что НСК  являются мультипотентными и существует возможность их культивирования in vivo, их применение влечет за собой массу сложностей. Выделение стволовых клеток нервной ткани связано с полным разрушением головного мозга, что делает невозможным применение аутологичного материала, а, как следствие этого, появляются те же проблемы этического и иммунологического характера, что и при использовании фетальных клеток.

Для клеточной терапии  НСК наиболее перспективны при использовании  их ортодоксального дифференцировочного потенциала (нейроны и глия). К настоящему моменту разработаны коктейли химических индукторов коммитации НСК к дифференцировке в одном направлении (Bithell and Williams 2005). НСК локализованы в субэпендимном клеточном слое 3 и 4 желудочков головного мозга (Romanko et al., 2004). Таким образом, выделение НСК связано с разрушением головного мозга донора (Rietze et al., 2001). Но при этом возможно использование аллогенного материала для клеточной терапии ЦНС в связи с наличием гематоэнцефалического барьера и отсутствием иммунологических реакций на чужеродный материал, введенный в ЦНС реципиента. Эксперименты с применением фетального материала при терапии болезни Паркинсона к настоящему моменту уже проведены как на экспериментальных животных, так и в клинике (Burnstein et al., 2004).

СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ КОЖИ

Стволовые клетки кожи выделяют из покровных тканей как эмбриона, так и взрослого организма. Клеточную терапию стволовыми клетками кожи связывают прежде всего с восстановлением кожных покровов, например, с восстановлением кожи после обширных ожогов. Сегодня подобные разработки уже применяют в клинике.

СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ СКЕЛЕТНОЙ  МУСКУЛАТУРЫ 

Стволовые клетки скелетной  мускулатуры выделяют из поперечнополосатой мускулатуры. Эти клетки способны к  дифференцировке в клетки нервной, хрящевой, жировой и костной тканей, а также, естественно, в клетки поперечнополосатой мускулатуры. Однако последние исследования показывают, что клетки скелетной  мускулатуры являются не чем иным, как отдельной популяцией мезенхимных  стволовых клеток (см. ниже).

СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ МИОКАРДА 

В 90-х гг. ХХ века из миокарда новорожденных крыс были выделены клеточные  элементы, способные к дифференцировке  в кардиомиоциты и эндотелий сосудов. Трансплантация таких клеток в область инфаркта миокарда приводит к развитию в зоне повреждения новых кардиомиоцитов и сосудов, в результате чего восстанавливаются функции органа. Однако методика выделения данных клеточных элементов очень сложна и связана с полным разрушением мышечной ткани сердца.

 

МЕЗЕНХИМНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ (МСК)

Традиционным источником МСК является строма костного мозга. В результате проведенных исследований мезенхимные стволовые клетки были обнаружены также в подкожной жировой ткани, которая в больших количествах остается после пластических операций.

Мезенхимные стволовые клетки человека рассматривают как один из основных элементов клеточной  терапии. Действительно, МСК плюрипотентны и могут дифференцироваться в клетки костной, жировой, мышечной, хрящевой, нервной и прочих тканей. Неоспоримым достоинством работы с МСК служит то, что существует возможность применения аутологичного материала. 

Источники МСК

 

 

Теоретически трансплантация стромальных клеток здорового донора способна ускорить процесс приживления трансплантата ГСК и, соответственно, процесс восстановления гемопоэза [17, 30, 43-49]. Существуют предпосылки, указывающие на целесообразность применения МСК в качестве ко-трансплантата при введении пациенту ГСК: 1) МСК поддерживают рост гемопоэтических клеток и клеток-предшественников, а также существенно стимулируют формирование мегакариоцитов и тромбоцитов in vitro [48, 50, 51]; 2) МСК продуцируют ряд важных гемопоэтических факторов роста, таких как IL6, IL11, LIF, SCF и Flt3-лиганд [50, 52, 53]; 3) МСК экспрессируют на своей поверхности протеины экстрацеллюлярного матрикса, участвующие в хоуминге стволовых клеток, в том числе: VCAM1, Е-селектин, коллаген I типа и фибронектин [13, 18, 52]. Практически, МСК дифференцируются в клетки стромы, способные синтезировать экстрацеллюлярный матрикс, формирующий костномозговое микроокружение, необходимое клеткам гемопоэза [54].

Ко-трансплантация человеческих МСК из костного мозга [11, 43, 55], эмбрионального легкого [56] и жировой ткани [57] совместно с человеческими ГСК улучшала долгосрочное приживление ГСК в костном мозге эмбриона овцы и иммунодефицитных NOD/SCID мышей [11, 26, 43, 44, 56-59]. Причем, МСК оказывали положительный эффект на восстановление всех ростков кроветворения: лимфоцитарный, миелоцитарный и промегакариоцитарный. Кроме того, одинаковое улучшение процесса приживления наблюдалось как при использовании ГСК и МСК от одного донора, так и от разных доноров. И, самое интересное, что при одинаковом количестве вводимых МСК, увеличение количества ГСК снижало выраженность наблюдаемого эффекта [11].

Все это в совокупности с описанными выше иммуномодулирующими  свойствами МСК позволяет предположить их успешное использование в качестве ко-трансплантатов при лечении различных патологий человека. Результаты первых клинических испытаний очень обнадеживают. При совместном введении ГСК и МСК КМ пациентам с острым миелоидным лейкозом [54] и раком молочной железы после высокодозного облучения [60] приживление трансплантата происходило в оптимальные сроки, при этом ни у кого из пациентов не наблюдалось тяжелой “реакции трансплантат против хозяина” (РТПХ) [36, 54, 60].

Теоретически способность  МСК снижать РТПХ может распространяться и на эффект «трансплантат против лейкемии» [27, 54], что, в свою очередь, может привести к повышенному риску развития рецидивов заболевания после трансплантации или возникновению опухолей “de novo” [61], однако таких случаев пока зафиксировано не было [27].

Классическим источником МСК является костный мозг, но, наряду с ним, МСК могут быть выделены и из других тканей: пуповинной крови, жировой ткани (ЖТ) [7, 62], тканей эмбриона [56]. Причем, клетки, полученные из разных источников, не отличаются ни по основным морфологическим признакам, ни по способности дифференцироваться в остеоциты, хондроциты, адипоциты и другие типы клеток соединительной ткани [7] при воздействии соответствующих биологических агентов.

Процедура забора КМ требует анестезии, травматична и может быть опасной для донора [63]. Кроме того, полученный при этом аспират далеко не всегда содержит большое количество МСК, поэтому клетки нуждаются в длительной «ex vivo», экспансии, что дорого, трудоемко, требует много времени и повышает вероятность микробной контаминации [7].

Более подходящим источником могут послужить обломки костей, содержащие КМ, но они доступны лишь при проведении операций на суставах. Плановые операции такого рода проводятся в основном пожилым пациентам, чей костный мозг уже атрофирован или патологически изменен и не может служить адекватным источником МСК. Получение же материала при проведении экстренных операций на суставах сопряжено с определенными трудностями.

МСК, получаемые из ПК, имеют крайне высокий пролиферативный потенциал, но их получение очень затруднено. Так, только из 60% образцов ПК удается выделить единичные МСК и это при условии, что в работе могут быть использованы образцы с чистым объемом не менее 33 мл, содержащие не менее 1´108 мононуклеаров и после получения которых прошло не более 15 часов [62]. Кроме того, несмотря на быстрое и активное деление, нарастить достаточное для практического применения количество клеток практически не представляется возможным в силу их недостаточного количества [63].

Ввиду вышесказанного, наиболее перспективным источником МСК представляется жировая ткань (ЖТ), получаемая в виде липоаспирата при проведении операции липосакции. Эта процедура минимально травматична и люди подвергаются ей совершенно добровольно в эстетических целях [64]. Причем, получаемый при этом материал, уничтожается. Таким образом, МСК жировой ткани, сами по себе обладающие хорошим пролиферативным потенциалом, могут быть получены в большом количестве, практически без финансовых затрат на заготовку нужного материала. Кроме того, при сравнении экспрессии генов МСК КМ и ЖТ, оказалось, что менее 1% генов отличается по уровню экспрессии. Причем, некоторые гены, обладающие более выраженной экспрессией на МСК ЖТ, такие как DKK-1 и ID, участвуют в регуляции пролиферации стволовых клеток. Возможно, это объясняет более высокий пролиферативный потенциал МСК ЖТ [8]. Иммуносупрессивная активность МСК ЖТ также не уступает активности МСК КМ [33].

Для изучения способности  МСК ЖТ поддерживать гемопоэз на протяжении продолжительного времени нами была избрана следующая тактика.

 

Выделение МСК из липоаспирата.

Для получения МСК липоаспират отмывался от примеси эритоцитов, после чего обрабатывался коллагеназой I типа и интенсивно промывался PBS. Полученные клетки высевались в культуральные флаконы с проницаемыми для газов крышками в специализированную среду для мезенхимальных клеток MesenCult (StemCell Technologies, Канада) и культивировались до достижения конфлюэнтности. Затем клетки трипсинизировались, отмывались PBS, высевались в 6-луночные планшеты в среду для выращивания стромальных клеток MyeloCult (StemCell Technologies, Канада) и подвергались g-облучению в дозе 16 Гр.

 

Выделение CD34+ клеток из ПК.

Мононуклеарная фракция выделялась из ПК по стандартной методике сепарации на растворе фиколл-верографин. После этого производилось выделение CD34+ клеток методом иммуномагнитной сепарации с помощью EasySep CD34+ Positive Selection Cocktail (StemCell Technologies, Канада). Суспензия мононуклеаров ПК в определенном соотношении смешивалась с входящими в набор антителами и инкубировалась. После этого к суспензии добавлялись EasySep магнитные наночастицы и проводилась 2-ая инкубация. По завершении инкубации пробирка помещалась в EasySep магнит и проводилась серия из 5 (или 6) последовательных 5-минутных инкубаций и промывок. Чистота полученной популяции оценивалась методом проточной цитофлюорометрии. Содержание СD34+ клеток составляло 75-91%.

 

Постановка LTC-IC культур.

Для постановки долгосрочных культур родоначальных клеток (LTC-IC) СD34+ клетки, полученные из ПК методом иммуномагнитной сепарации, культивировались с предварительно облученными МСК ЖТ в качестве питательной подложки в среде для стромальных клеток в течение 5 недель. Еженедельно проводилась смена ½ объема среды, а после завершения срока культивированиия клетки обрабатывались трипсином, отмывались и использовались для постановки стандартного теста колониеобразования в полутвердой метилцеллюлозной среде MethoCult (StemCell Technologies, Канада).

В качестве стендовой модели для изучения иммуносупрессивных свойств МСК использовался «Тест подвижности лимфоцитов» [65],  выявляющий изменения величины электрофоретической подвижности (ЭФП) пар мононуклеаров, различающихся по антигенам гистосовместимости I класса при их совместном культивировании. МСК вносились в смешанную культуру лимфоцитов двух здоровых доноров в соотношении лимфоцитов и МСК 50:1 и проводилось измерение электрофоретической подвижности (ЭФП) суммарной популяции лимфоцитов после инкубации с МСК. В случае развития иммунного ответа наблюдается изменение ЭФП более чем на 4%. В случае же отсутствия иммунного ответа величина ЭФП мононуклеаров не изменяется. Предположительно это обусловлено изменением клеточных мембран при инициировании иммунного ответа.