Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки

 

Результаты и их обсуждение.

На второй неделе совместного  культивирования МСК ЖТ и ГСК ПК было отмечено появление так называемых зон «булыжной мостовой», представляющих собой участки поверхности, покрытые плотно прилегающими друг к другу клетками характерной формы. При наблюдении в инвертированном микроскопе такие зоны напоминают по внешнему виду булыжную мостовую. Эти области представляют собой скопления наиболее ранних незрелых клеток-предшественников гемопоэза и соответствуют очагам активного кроветворения in vivo [66]. В течение последующих недель морфология скоплений клеток постепенно изменяется, что свидетельствует об их созревании (рис. 1).

 

Рис.1. Зоны «булыжной мостовой»: А – 1 неделя, Б – 2 недели, В – 3 недели.

При внесении популяции клеток, сформировавшейся в результате пятинедельного совместного культивирования с  МСК, в метилцеллюлозную среду, содержащую комплекс ростовых факторов, нами был зафиксирован интенсивный рост колоний всех типов, включая смешанные колонии, состоящие из клеток всех ростков кроветворения, родоначальниками которых являются наиболее незрелые предшественники гемопоэза. Количественный учет колоний различных типов был затруднен из-за их большой плотности.

В тесте подвижности лимфоцитов при внесении в смешанную культуру лимфоцитов определенного количества МСК и их совместном культивировании изменения ЭФП мононуклеаров не наблюдалось, причем в контрольных постановках (без МСК) ЭФП достоверно повышалось более чем на 4%. Это указывает на то, что иммуносупрессивные свойства МСК, широко освещенные в литературе, проявляются уже на первых этапах развития иммунного ответа, что может сыграть определенную положительную роль для приживления трансплантата ГСК при их совместном введении.

Приведенные литературные данные и собственные результаты позволяют  утверждать, что при совместном культивировании  ГСК и МСК ЖТ последние способны поддерживать рост и развитие ГСК и, кроме того, они обеспечивают условия, необходимые для поддержания в популяции клеток достаточного количества ранних предшественников, играющих ключевую роль в процессе восстановления гемопоэза. Благодаря этой способности, а также своей низкой иммуногенности и иммуносупрессивным свойствам мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани могут рассматриваться в качестве ко-трансплантата при использовании гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови для терапии различных заболеваний.

 

 

Архив номеров / Номер 3, 2011 год Распечатать

Актуальные проблемы применения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в современной ветеринарной медицине

 

Калиновский А.А. ФГОУ ВПО "Московская государственная академия

ветеринарной медицины и  биотехнологии имени К.И.Скрябина"

 

Мезенхимальные стромальные клетки (МСК), это недифференцированные мультипотентные клетки, которые могут быть выделены из таких тканей взрослого организма, как костный мозг, жировая ткань и т.д., способные дифференцироваться в костную, хрящевую, жировую и мышечную ткани [2,4,27], а также к самовоспроизведению через деление [13].

 

МСК участвуют в регенерации тканей двумя путями. Первый - они напрямую восстанавливают поврежденные ткани за счет дифференциации в те или иные виды клеток, например в фибробласты сухожилий или связок. Второй - МСК продуцируют биоактивные протеины, такие, как различные факторы роста, факторы, прекращающие нежелательный апоптоз и обеспечивающие хемотаксис. Все это создает в месте повреждения анаболический эффект, стимулирует неоваскуляризацию и привлекает в это место дополнительные МСК, которые, в свою очередь, дифференцируются и/или продуцируют дополнительные биологически активные пептиды [11].

 

В медицине человека МСК идентифицируют по их способности к адгезии к пластику in vitro, способности к дифференциации в различные типы тканей, а также по комбинации экспрессии поверхностных клеточных маркеров (CD 105, CD 73, CD 90) и отсутствию маркеров (CD 34, CD 45) В ветеринарной медицине характеристика МСК более сложная, т.к. существующие клеточные маркеры не вступают в реакцию с клетками животных. До сих пор не понятно, вызвано ли это отсутствием самих клеточных маркеров или просто клеточные маркеры человека не в состоянии вступать в реакцию с клетками животных. Только способность к адгезии к пластику и способность к дифференциации в три основных типа тканей являются, на данный момент, основными характеристиками МСК животных.

 

В последние годы, термин "мезенхимальные стромальные клетки" широко используют для всех типов мезенхимальных клеток предшественников. Международное Общество Клеточной Терапии предложило к употреблению термин "мультиполентные мезенхимальные стромальные клетки" (ММСК) для более точной классификации в научной литературе тех клеток, которые способны дифференцироваться в различные типы тканей и способные к длительному самовоспроизведению [16]. Этот факт особенно актуален для ветеринарной медицины, поскольку необходимо учитывать клеточную видоспецифичность у животных.

 

В настоящее время ММСК уже апробированы в ветеринарной медицине. Так, их с успехом применяют при лечении лошадей с тендопатиями и собак с остеоартрозами. Более того, результаты, полученные при лечении животных, являются с базовыми, для дальнейшего использования ММСК в медицине человека. Проблема выявления эффектов от применения ММСК имеет общебиологическое значение, при ее решении интересы врачей ветеринарной медицины и медицины человека плотно соприкасаются и успехи могут быть достигнуты только совместными усилиями.

 

Исследование эмбриональных  стволовых клеток (ЭСК), по этическим  соображениям, в основном проводится только на животных. ЭСК представляют большой интерес, поскольку известно, что они могут дифференцироваться в любую ткань организма [20]. Эти  клетки способны к самовоспроизведению  и при культивировании в питательной  среде сохраняют жизнеспособность до 2-х лет. Тем не менее, применение этих клеток в клинической практике невозможно вследствие их тератогенности in vivo.

 

Стволовые клетки, полученные из организма после его рождения, называются взрослыми стволовыми клетками. Это гемо-поэтические (ГСК) и мезенхимальные стромальные клетки (МСК). Очевидно, что эти два типа взрослых стволовых клеток служат своеобразным депо для поддержания жизнедеятельности взрослого организма и являются объектом пристального изучения специалистами для использования их в клеточно-регенеративной терапии (КРТ).

 

В сравнении с медициной  человека, применение гемопоэти-ческих стволовых клеток в ветеринарной медицине не нашло широкого распространения по причине ограниченного применения как химио- так и лучевой терапии, а так же по экономическим соображениям.

 

Наоборот, КРТ, использующая МСК, все более широко внедряется в повседневную клиническую практику. В США с 2003 года их с успехом применяют при артропатиях и тендопатиях у собак и лошадей. За это время было излечено более 2500 животных каждого вида.

 

У животных, как и у человека, многие ткани являются источником для  получения ММСК. Однако, в ветеринарной медицине необходимо учитывать не только качественные и количественные цито-морфологические критерии, но и видовые особенности животных. Т.е. в клинической практике для получения ММСК не всегда можно использовать те ткани, которые считаются оптимальными для данного конкретного случая. Более того, существующие морфофункци-ональные отличия ММСК, полученных из разных типов тканей, не могут быть экстраполированы с одного вида животных на другой.

 

Доказано, что костный  мозг является лучшим источником для  получения ММСК. Методы выделения  ММСК из костного мозга описаны для  таких видов животных как кролики, мыши, крысы, лошади, собаки [10, 15], кошки, и КРС.

 

Костный мозг содержит не только мезенхимальные фиброб-ластоподобные клетки, но и большое количество гемопоэтических клеток. ММСК без труда отделяются от ГСК путем культивирования и идентифицируются по их адгезии к пластику.

 

Преимуществом ММСК, полученных из костного мозга, является то, что  они могут быть культитвированы в питательной среде на протяжении длительного периода времени] и имеют высокую пролиферативную активность. Следует иметь ввиду, что количество ММСК, полученных из одинаковых по объему образцов костного мозга, у разных видов животных различное [26].

 

Тем не менее, на наш взгляд, костный мозг не может являться оптимальным  источником для получения ММСК, т.к. сама процедура болезненна, кроме  того, при ее выполнении существует риск возникновения геморрагий, инфицирования  и развития сепсиса. Не следует забывать, что сама процедура получения  костного мозга небезопасна для  ветеринарного врача, особенно у  лошадей.

 

Вторым по значимости источником ММСК является жировая ткань. Несмотря на то, что количество ММСК во фракции  ядросо-держащих клеток в материале, полученном из жировой ткани, меньше, чем количество ММСК, полученных из костного мозга, жировая ткань имеет ряд преимуществ. Прежде всего, взятие образцов жировой ткани, не является сложной процедурой даже у крупных животных. Анализ ММСК, полученных из ЖТ и КМ у лошадей, показал, что они имеют одинаковую способность к дифференциации в три основных типа тканей - костную, хрящевую и жировую. Было доказано, что пролиферативная способность ММСК-ЖТ в два раза выше, также быстрее происходит, как деление эти клеток, так и их миграция в область нанесенной раны [21]. Тот же автор показал, что способность к дифференциации в хрящевую ткань у ММСК-ЖТ собак ниже, чем у ММСК-КМ, в то время, как дифференциация в костную ткань одинаковая.

 

Особенность работы с ММСК-ЖТ заключается в том, что они  требуют перед введением тщательного  выделения и культивирования  в питательной среде на пластике, перед введением. Применение ММСК без  предварительного выделения и культивирования  не может быть, по нашему мнению, отнесено к клеточно-регенератив-ной терапии.

 

Помимо двух источников ММСК, широко применяющихся в клинической  практике, существуют и другие, исследования над которыми продолжаются. Периферическая кровь - наиболее доступный и безболезненный способ получения материала для  выделения ММСК. Однако, до сих пор стандартные протоколы разработаны только лабораторных животных: мышей, морских свинок и кроликов. При этом за основу берутся протоколы для получения ММСК-КМ. Использование аналогичного протокола для лошадей не дало желаемого результата. Выделение фибробластоподобных клеток у человека и собак достаточно сложное, а у лошади только 36,4% случаев дало рост необходимой популяции клеток. В этом случае появление 1-5 колоний клеток было зафиксировано на 14-й день наблюдений.

 

В отличие от медицины человека, в ветеринарной медицине только в  последние годы стали использовать пуповинную кровь (ПК). Первые попытки  получения и хранения ММСК-ПК были описаны у лошадей [автор]. Получение  пуповинной крови технически не представляет труда.

 

ММСК-ПК, в отличие от других взрослых стволовых клеток, имеют  способность дифференцироваться в  типы тканей мезо-дермального и энтодермального происхождения, например, в гепатоциты. В дополнение, укажем, что Oct4 - маркерный белок эмбриональных стволовых клеток - был обнаружен более чем у 90% ядросодержащих клеток пуповинной крови. Сравнительно с другими источниками ММСК, количество клеток, полученных из ПК небольшое, только в 4-х из 7-ми образцов отмечали рост колоний [17]. ММСК-ПК лошадей дифференцируются в костную, хрящевую и жировую ткани [17, 20]. Глубокая заморозка и последующая де-фростация не влияют на морфологию клеток. Можно полагать, что это может быть с успехом использовано для длительного хранения и последующего применения аутологичных клеток [17].

 

Помимо вышеперечисленных  источников, ММСК возможно выделить и  из других органов и тканей организма, таких как пуповина, синовиальная мембрана, периодонтальная связка, кожа [25], мышечная ткань, мозга, синовиальная жидкость [25], сухожилия и надкостница. В настоящее время неуклонно растет число исследований, направленных на разработку методов выделения взрослых стволовых клеток из всех имеющихся источников и дальнейшее применение их в клинической ветеринарной практике.

 

Вместе с тем, следует  подчеркнуть, что механизм иммуноген-ности взрослых ММСК до сих пор до конца не расшифрован. Считают, что они гипоиммуногенны, подавляют активность Т-лимфоцитов и дендритных клеток как у человека, так и у животных. В норме ал-логенные ММСК должны быть отторгнуты за счет иммунного ответа, однако показано, что этого не происходит. Доказано, что при введении аллогенных клеток нет пролиферативного ответа Т-лимфоцитов. Предполагают, что такие клетки обладают иммуносупрессорной способностью [23].

 

Высказывают мнение об отсутствии главного комплекса гисто-совместимости (ГКГ) 2-го класса у ММСК мышей, а также пониженную активность Т-лимфоцитов. Так же было отмечено, что у людей применение аллогенных ММСК не вызывает ответа Т-лимфоцитов даже при нерегулируемом ГКГ. Аллогенные ММСК павианов in vitro подавляют активность лимфоцитов и имеют увеличенную продолжительность жизни, вызывая противовоспалительный и регенераторный эффекты [18].

 

Исследования доказали, что  ММСК являются иммуноприви-легированными и, в дальнейшем, возможно их использование в клеточно-регенеративной медицине. При этом не надо забывать, что возможен риск трансмиссии некоторых заболеваний от донора к реципиенту [13].

 

Клеточно-регенеративная терапия  все более широко используется в  повседневной ветеринарной практике. Доказано, что специальные рецепторы, отвечающие за хемотаксис, способны реагировать  на сигналы поврежденных тканей [14]. В ответ на эти сигналы ММСК мигрируют в поврежденные ткани  и вызывают регенерацию.

 

Тем не менее, не все виды лечения, где применяются стволовые  клетки, могут называться КРТ. Примером применения ошибочной терминоголии является употребление термина КРТ к прямому введению пунктата костного мозга или суспензии ядросодержащих клеток жировой ткани. Дело в том, что трансплантат состоит, в основном, из смеси ядросодержащих клеток с незначительным количеством истинно мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток.

 

В настоящее время клеточно-регенеративную терапию активно используют при  лечении лошадей с травмами сухожилия  поверхностного сгибателя пальца. При  применении традиционных методов лечения  на месте травмы образуется фиброзный  рубец, но его ткань неполноценна в биомеханическом отношении, поэтому  всегда существует риск получения повторной  травмы [24]. Применение КРТ вызывает регенерацию сухожильной ткани, восстанавливает эластичность сухожилия  и значительно снижает риск повторного травмирования. Существует две теории воздействия ММСК на пораженный участок. Первая базируется на том, клетки дифференцируются в тендиноциты и вызывают заживление путем продуцирования коллагена. Вторая - что приоритетное значение в процессах регенерации придается локальным факторам роста, выделяемых инъецированными в область травмы клетками и их дифференциации [9, 22].