Новые направления клеточной биологии

Новые направления клеточной биологии

Конец ХХ и начало XXI века ознаменовались всплеском интереса к проблемам клеточной биологии. В значительной степени это связано с тем, что достижения в этой области могут оказаться исключительно перспективными для репаративной медицины, т.е. той части медицины, которая занимается пересадкой, восстановлением и воссозданием у человека искусственных органов взамен больных или утраченных.

В современной трансплантологии в большинстве случаев используются человеческие донорские ткани и органы, из-за чего после трансплантации возникает ряд неизбежных осложнений. Конечно, по сравнению с вопросом жизни и смерти они могут показаться незначительными, но все же большинство из них меняет качество жизни пациента, получившего донорский орган. Прежде всего, это необходимость пожизненной иммуносупрессии – подавления иммунных реакций пациента для предотвращения или ослабления тканевой несовместимости (реакции «трансплантат против хозяина» и «хозяин против трансплантата»). Актуальным остается вопрос о возможности передачи пациенту опасных заболеваний вместе с пересаженными органами. Ну и, кроме того, до сих пор сохраняется и, по всей видимости, останется таковым в ближайшие годы острый дефицит донорских органов.

Есть и другая сторона проблемы: существуют состояния, при которых хирургическое вмешательство невозможно или малоэффективно, например когда больной страдает выраженным недостатком функционально активной ткани.

О том, что в ближайшие десятилетия, скорее всего, мы сможем отказаться от трансплантации большей части донорских органов и повысить уровень регенерационных процессов в тканях организма, свидетельствуют обнадеживающие результаты, полученные в таких направлениях медицинской науки о трансплантации органов и тканей, как клеточная трансплантология и тканевая инженерия.

Клеточная трансплантология предполагает введение клеток в больной организм для его лечения. Она может проводиться для замещения нефункционирующей или дефектной ткани или клеточной популяции; стимуляции собственных стволовых клеток организма и усиления репаративной регенерации и даже для адресной доставки лекарственных средств, генетических конструкций и биомолекул.

Тканевая инженерия позволяет решить вопрос о том, где, а главное – как получить достаточное для восстановления органов и тканей количество регенерационного материала для последующей трансплантации, и занимается созданием биоискусственных, или биоартифициальных, органов с последующей пересадкой их в организм.

Клетки, используемые как в клеточной трансплантологии, так и в тканевой инженерии, могут быть собственными (аутогенными), донорскими (аллогенными) или взятыми у животного с предварительно подавленным иммунитетом (ксеногенными). Еще в середине прошлого века морфологи и биологи научились их культивировать вне организма так же, как выращивали бактерии и дрожжи, и длительно поддерживать культуру клеток в живом состоянии. Это позволило вплотную подойти к возникновению и развитию новых отраслей клеточной биологии.

Клеточная трансплантология

Немного истории

Сама идея об использовании вносимых извне клеток для лечения организма возникла более века назад. Уже в 1890 г. Томсон в Нью-Йоркском университете проводит эксперименты по пересадке клеток головного мозга от кошки собаке. В 1884 г. Вильямс подкожно имплантирует больному сахарным диабетом фрагменты ткани поджелудочной железы овцы. Однако первой научно обоснованной клеточной трансплантацией у человека считается проведенное Р.Оттенбергом в 1907 г. переливание АВ0-совместимой крови.

В 1931 г. в Швейцарии Пауль Ниханс спас от смерти больную, которая после ошибочного удаления паращитовидной железы находилась в судорожном состоянии, – он впервые в мире пересадил ей суспензию клеток этой железы от теленка. Интересно, что в это время П.Ниханс разрабатывал метод «замораживания–высушивания» кофе для компании «Nestle» и удачно применил его для заморозки клеток животных, которые затем пересаживал. После такого успеха терапия с помощью замороженных клеток животных и человека, получившая название «метод Ниханса», широко распространилась в Западной Европе. Примерно в это же время во Франции русский врач С.Воронцов занимается процессами омоложения, делая пожилым людям инъекции фетальных (эмбриональных) клеток животных и человека.

Кроме описаний успешных экспериментов, в научных журналах появлялось немало сообщений и о летальных исходах из-за инфекций и иммунных реакций, вследствие чего в конце 1980-х гг. «клеточную терапию» запретили в Германии, а затем и в США.

Современный этап развития клеточной терапии начался с 1968 г., когда Е.Д. Томас (Университет штата Миннесота, США) впервые в мире пересадил больному лейкемией костный мозг, взятый у его родственника. А к настоящему времени этот метод стал практически безальтернативным способом лечения онкологических заболеваний крови.

В конце ХХ в. начали интенсивно развиваться нейротрансплантация, клеточная кардиомиопластика, пересадка островковых клеток поджелудочной железы. В последние годы стали активно изучать стволовые клетки (эмбриональные и взрослого организма) как более перспективный клеточный материал для трансплантации. Основные события в истории развития клеточной трансплантации приведены в таблице 1.

Таблица 1. Основные события в истории развития клеточной трансплантологии (по Берсеневу А.В., 2005)

Год	Событие
1667	Д.-Б. Денис (Франция) сделал первую попытку переливания крови от овцы человеку
1907	Р.Оттенберг впервые в мире провел переливание от человека человеку крови, совместимой по группам АВ0, открытым K.Лендстейнером в 1901 г.
1931	Первая клеточная терапия у человека: П.Ниханс выполнил инъекцию суспензии паращитовидной железы теленка пациентке с судорожным синдромом
1951	Впервые продемонстрирована выживаемость летально облученных животных после трансплантации костного мозга (Лоренц с сотр.)
1958	Ж.Мате провел трансплантацию костного мозга облученным физикам-ядерщикам. Трансплантация оказалась не слишком эффективной, поскольку совместимость определялась только по группам крови и перед пересадкой не было проведено подавление иммунных реакций отторжения
1968	Первая успешная трансплантация HLA-совместимого костного мозга больному лейкемией. Начало современного этапа клеточной терапии
1972	Экспериментальное обоснование эффективности трансплантации островковых клеток поджелудочной железы для лечения сахарного диабета
1981	Выделение эмбриональных стволовых клеток из бластоцисты мыши. Появление термина «эмбриональная стволовая клетка», показаны возможности ее дифференцировки и перспективы использования для клеточной трансплантации
1986	Первое клиническое испытание трансплантации островковых клеток поджелудочной железы больным сахарным диабетом. Основание Общества клеточной трансплантации
1987	Трансплантация ткани надпочечников в головной мозг двум пациентам с болезнью Паркинсона, пересадка эмбриональной нервной ткани человека (Швеция)
	«Клеточная терапия» для лечения синдрома Дауна была признана неэффективной (Австралия)
1988	Первая успешная трансплантация клеток пуповинной крови 5-летнему мальчику, больному анемией (Франция)
1992 – 1994	Первые трансплантации гепатоцитов больным с печеночной недостаточностью
1996	Первая клеточная генотерапия в клинике: трансплантация клеток печени, трансфецированных геном рецептора липопротеидов низкой плотности пяти детям с семейной гиперхолестеринемией
	Клинические испытания метода трансплантации гемопоэтических клеток при рассеянном склерозе
1997	Первый коммерческий клеточный продукт – аутологичные хондроциты для восстановления суставной поверхности (компания «Genzyme corporation», США)
1998	Успешная трансплантация гепатоцитов ребенку с наследственной формой желтухи
	Первая трансплантация нервных клеток в головной мозг пациентке 62 лет, перенесшей инсульт (Медицинский центр Питтсбургского университета)
	Первая в мире аутологичная трансплантация пуповинной крови, сохраненной в криобанке
	Описание выделения эмбриональных стволовых клеток человека из бластоцисты
2001	Первые опубликованные данные по введению клеток в сердце человека для улучшения его функции после инфаркта
2002	Трансплантация стромальных клеток костного мозга детям с несовершенным остеогенезом
2004	Успешное получение линий эмбриональных стволовых клеток человека методом переноса ядра соматической клетки
2005	Создание индивидуальных линий эмбриональных стволовых клеток методом переноса ядра соматической клетки пациента

Развитие современной клеточной терапии

Трансплантация клеток является основным инструментом современной регенеративной медицины и включает следующие последовательные этапы: выделение клеток из ткани, их очистку, фракционирование, культивирование, ген-модификацию и др. и введение в организм донора. Все разнообразие клеточных технологий и направлений, образующих современную регенеративную медицину, представлены на рис. 1.

Рис. 1. Основные направления клеточных технологий

В настоящее время разработаны методы, позволяющие выделять нужную популяцию клеток и хранить ее в криобанках. Это обеспечивает постоянный доступ к трансплантационному материалу и дает возможность помочь большему числу больных.

Для клеточной трансплантации используют как стволовые, так и дифференцированные клетки (гепатоциты, бета-клетки поджелудочной железы, фибробласты, хондроциты). Экспериментально доказано, что даже небольшое количество высокоспециализированных клеток может компенсировать функцию пораженного органа.

Клеточная трансплантология тесно связана с пептидной терапией, которая возникла при изучении механизмов действия пересаженных клеток и регенерации их в организме, и затем выделилась в отдельное направление регенеративной медицины. Среди способов лечения, предлагаемых пептидной терапией, – введение рекомбинантных факторов роста, стимулирующих регенерационные процессы в ткани. Однако после введения рекомбинантных факторов роста или некоторых генных конструкций возможно образование антител и отторжение трансплантата, в то время как использование для пересадки собственных клеток позволяет избежать необходимости подавлять иммунные реакции отторжения, имеющие место при пересадке донорских органов.

Однако, будучи одной из самых активно развивающихся областей медицины, клеточная трансплантология сталкивается в клинике с целым рядом осложнений (табл. 2).

Таблица 2. Осложнения при клеточной трансплантации

Клинические осложнения	Осложнения, описанные в экспериментальных исследованиях и потенциально опасные в клинике
Иммунологические реакции, анафилаксия	Образование опухолей
Клеточная (тканевая) эмболия	Тканевая эмболия и микроинфаркты органов
Связанные с токсичностью криопротектора	Эктопическая оссификация
	Фиброз и образование рубца

Клиническое применение

За последние десятилетия было предложено более тысячи экспериментальных разработок, и только единицы стали применяться в клинической практике. Однако их значение огромно. Например, благодаря внедрению трансплантации гемопоэтических клеток некоторые формы детской лейкемии и анемий стали принципиально излечимы, а сотни больных сахарным диабетом смогли обходиться без ежедневных инъекций инсулина после введения островковых клеток поджелудочной железы.

Если раньше трансплантация костного мозга приравнивалась к пересадке органа и эту операцию могли выполнять только в крупных лечебных центрах, теперь как альтернатива широко внедряется трансплантация клеток пуповинной крови и гемопоэтических клеток.

Перспективы развития клеточной трансплантологии

Развитие современной клеточной трансплантологии и ее внедрение в клинику в последние десятилетия позволило продлить жизнь многим тысячам пациентов. В настоящее время наука о трансплантации клеток остается одной из самых интенсивно развивающихся областей биологии и медицины. Уже проходят клинические испытания такие методы, как:

– трансплантация собственных гемопоэтических клеток при рассеянном склерозе, системной красной волчанке, ревматоидном артрите;

– трансплантация гемопоэтических клеток при лечении злокачественных опухолей почек, молочной и поджелудочной желез, головного мозга;

– трансплантация донорских стволовых клеток для профилактики реакции «трансплантат против хозяина» после предшествующей трансплантации гемопоэтических клеток;

– адаптивная иммунотерапия (цитотоксические Т-лимфоциты) в онкологии, клеточные онковакцины;

– трансплантация миобластов скелетной мышечной ткани;

– трансплантация нейрональных клеток пациентам с постинсультным синдромом;

– трансплантация собственных и донорских клеток костного мозга для улучшения регенерации костной ткани после переломов.

Успехи в области изучения стволовых клеток во многом обусловлены повышенным интересом ученых и клиницистов к перспективам их использования в лечении заболеваний, в настоящее время считающихся неизлечимыми. Однако при этом возникает много этических вопросов (таких, например, как использование в качестве трансплантационного материала клеток эмбрионов человека), а также вопросов, связанных с правовой регуляцией клеточных технологий. В развитии клеточных технологий наиболее перспективными считаются следующие направления:

– выделение и трансплантация стволовых клеток, в том числе собственных клеток пациента;

– выявление субпопуляций и клонов стволовых клеток;

– тестирование безопасности трансплантации (инфекционной, онкогенной, мутагенной), составление «клеточного паспорта»;

– выделение индивидуальных линий эмбриональных стволовых клеток методом переноса ядра соматической клетки;

– коррекция генетических дефектов пренатальной трансплантацией клеток или комбинацией методов переноса ядра и генетической терапии.

Тканевая инженерия

Одним из направлений биотехнологии, которое занимается созданием биологических заместителей тканей и органов, является тканевая инженерия (ТИ).

Современная тканевая инженерия начала оформляться в самостоятельную дисциплину после работ Д.Р. Уолтера и Ф.Р. Мейера (1984), которым удалось восстановить поврежденную роговицу глаза с помощью пластического материала, искусственно выращенного из клеток, взятых у пациента. Этот метод получил название кератинопластика. После симпозиума, организованного Национальным научным фондом США (NSF) в 1987 г., тканевая инженерия стала считаться новым научным направлением в медицине. К настоящему времени большинство работ в этой области выполнено на лабораторных животных, но часть технологий уже используется в медицине.

Создания искусственных органов состоит из нескольких этапов (рис. 2).

Рис. 2. Схема процессинга тканеинженерных конструкций

На первом этапе отбирают собственный или донорский клеточный материал (биопсия), выделяют тканеспецифичные клетки и культивируют их. В состав тканеинженерной конструкции, или графта, кроме культуры клеток входит специальный носитель (матрица). Матрицы могут быть выполнены из различных биосовместимых материалов. Клетки полученной культуры наносятся на матрицу, после чего такая трехмерная структура переносится в биореактор1 с питательной средой, где инкубируется в течение определенного времени. Первые биореакторы были созданы для получения искусственной печеночной ткани.

Для каждого типа выращиваемого графта подбирают специальные условия культивирования. Например, для создания искусственных артерий используют проточный биореактор, в котором поддерживается постоянный проток питательной среды с переменным пульсовым давлением, имитирующим пульсацию тока крови.

Иногда при создании графта используют технологию префабрикации: конструкцию вначале помещают не на постоянное место, а в область, хорошо снабжаемую кровью, для дозревания и формирования микроциркуляции внутри графта.

В качестве клеточного материала для создания искусственных органов применяют культуры клеток, входящих в состав регенерируемой ткани или являющихся их предшественниками. Так, например, при получении графта для реконструкции фаланги пальца были использованы приемы, вызывающие направленную дифференцировку стволовых клеток костного мозга в клетки костной ткани.