Окраска микроорганизмов, окислительное фосфолирирование

Расположение спор в клетке:

- центральное (возбудитель сибирской язвы);

- субтерминальное - ближе к концу (возбудитель ботулизма);

- терминальное – на конце палочки (возбудитель столбняка).

 

Методы выявления капсул, жгутиков, спор

 

Для выявления  некоторых бактерий и отдельных  структур клеток применяют специальные  методы окраски.

Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нильсена:

1. На фиксированный  мазок наносят карболовый раствор  фуксина через полоску фильтровальной  бумаги и подогревают до появления  паров в течение 3-5 минут.

2. Снимают  бумагу, промывают мазок водой.

3. На мазок  наносят 5% раствор серной кислоты  или 3% раствор солянокислого спирта  на 1-2 минуты для обесцвечивания.

4. Промывают  водой.

5.   Докрашивают  мазок водным раствором метиленового синего в течение 3-5 минут.

6. Промывают  водой, высушивают и микроскопируют.

Выявление капсулы по методу Гинса:

1. На предметное  стекло наносят каплю туши, а  рядом – каплю исследуемого  материала. Обе капли тщательно  перемешивают и с помощью шлифованного  стекла готовят мазок.

2. Мазок высушивают  на воздухе и фиксируют на  пламени горелки.

3. Мазок окрашивают  фуксином в разведении 1:3 или сафранином. При этом бактерии окрашиваются  в красный цвет, капсулы остаются  неокрашенными и выделяются на  темном фоне препарата.

Окраска жгутиков по Леффлеру:

1. Взвесь бактерий  переносят в каплю воды, не  перемешивают и высушивают.

2. Обрабатывают  препарат 15-20 минут протравой (1 мл  насыщенного спиртового раствора  фуксина + смесь из 10 мл 25% водного  раствора танина с 5 мл насыщенного  водного раствора сернокислого  железа).

3. Тщательно  промывают водой и высушивают  на воздухе.

4. Докрашивают  фуксином Циля в течение 3-4 минут при легком подогревании.

5. Промывают  водой, высушивают, микроскопируют.

Окраска спор по методу Ожешки:

1. На нефиксированный  мазок наносят 0,5% раствор хлористоводородной  кислоты и подогревают на пламени  горелки в течение 2-3 минут.

2. Кислоту  сливают, препарат промывают водой,  просушивают и фиксируют над  пламенем горелки.

3. Окрашивают  препарат по Цилю-Нильсену. Споры бактерий при этом приобретают красный цвет, а вегетативные формы – синий.

 

Изучение микробов в живом состоянии

 

Клетки микроорганизмов  в живом состоянии изучают  методом раздавленной капли и  методом висячей капли.

Метод раздавленной капли. На поверхность обезжиренного предметного стекла наносят каплю исследуемого материала или суспензию бактерий и покрывают ее покровным стеклом. Капля должна быть небольшой, не выходящей за края покровного стекла. Микроскопируют препарат с объективом х40. Метод раздавленной капли удобен для исследования подвижности бактериальных клеток, а также для изучения крупных микроорганизмов - плесневых грибов, дрожжей.

Метод висячей капли. Препарат готовят на покровном стекле, в центр которого наносят каплю бактериальной суспензии. Затем предметное стекло с лункой, края которого предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Препарат переворачивают покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном препарате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края. Для микроскопии используют вначале малый сухой объектив х8, под увеличением которого находят края капли, а затем устанавливают объектив х40 и исследуют препарат

Окислительное фосфорилирование

 

Окислительное фосфорилирование, синтез АТФ из аденозиндифосфата и неорганического фосфата, осуществляющийся в живых клетках, благодаря энергии, выделяющейся при окислении органических веществ в процессе клеточного дыхания. В общем виде окислительное фосфорилирование и его место в обмене веществ можно представить схемой:

 

АН2-органические вещества, окисляемые в дыхательной цепи (так называемые субстраты окисления, или дыхания), АДФ-аденозиндифосфат, Р-неорганический фосфат.

Поскольку АТФ необходим для осуществления многих процессов, требующих затраты энергии (биосинтез, совершение механической работы, транспорт веществ и др.), Окислительное фосфорилирование играет важнейшую роль в жизнедеятельности аэробных организмов. Образование АТФ в клетке происходит также благодаря другим процессам, например в ходе гликолиза и различных типов брожения, протекающих без участия кислорода. Их вклад в синтез АТФ в условиях аэробного дыхания составляет незначительную часть от вклада окислительного фосфорилирования (ок. 5%).

У животных, растений и грибов окислительное фосфорилирование протекает в специализированных субклеточных структурах-митохондриях (рис. 1); у бактерий ферментные системы, осуществляющие этот процесс, находятся в клеточной мембране.

Митохондрии окружены белково-фосфолипидной мембраной. Внутри митохондрий (в матриксе) идет ряд метаболических процессов распада пищевых веществ, поставляющих субстраты окисления АН₂ для окислительного фосфорилирования. Наиболее важные из этих процессов - трикарбоновых кислот цикл и так называемое - окисление жирных кислот (окислительное расщепление жирной кислоты с образованием ацетил-кофермента А и кислоты, содержащей на 2 атома С меньше, чем исходная; вновь образующаяся жирная кислота также может подвергаться - окислению). Интермедиаты этих процессов подвергаются дегидрированию (окислению) при участии ферментов дегидрогеназ; затем электроны передаются в дыхательную цепь митохондрий-ансамбль окислительно-восстановительных ферментов, встроенных во внутреннюю митохондриальную мембрану. Дыхательная цепь осуществляет многоступенчатый экзэргонический перенос электронов (сопровождается уменьшением свободной энергии) от субстратов к кислороду, а высвобождающаяся энергия используется расположенным в той же мембране ферментом АТФ-синтетазой, для фосфорилирования АДФ до АТФ. В интактной (неповрежденной) митохондриальной мембране перенос электронов в дыхательные цепи и фосфорилирование тесно сопряжены между собой. Так, например, выключение фосфорилирования по исчерпании АДФ либо неорганического фосфата сопровождается торможением дыхания (эффект дыхательного контроля). Большое число повреждающих митохондриальную мембрану воздействий нарушает сопряжение между окислением и фосфорилированием, разрешая идти переносу электронов и в отсутствие синтеза АТФ (эффект разобщения).

 

Механизм  окислительного фосфорилирования можно представить схемой: Перенос электронов (дыхание)  А ~ ВАТФ А ~ В-высокоэнергетических интермедиат. Предполагалось, что А ~ В – химические соединения с макроэргической связью, например фосфорилирование ферментов дыхательной цепи (хим. гипотеза сопряжения), или напряженная конформация к.-л. белка, участвующего в окислительном фосфорилировании (конформация гипотеза сопряжения). Однако эти гипотезы не получили эксперимент подтверждения. Наибольшим признанием пользуется хемиосмотическая концепция сопряжения, предложенная в 1961 П. Митчеллом (за развитие этой концепции в 1979 ему присуждена Нобелевская премия). Согласно этой теории, свободная энергия транспорта электронов в дыхательной цепи затрачивается на перенос из митохондрий через митохондриальную мембрану на ее наружную сторону ионов Н⁺ (рис. 2, процесс 1). В результате на мембране возникает разность электрических потенциалов   и разность химических активностей ионов Н⁺   (внутри митохондрий рН выше, чем снаружи). В сумме эти компоненты дают трансмембранную разность электрохимических потенциалов ионов водорода  между матриксом митохондрий и внешней водной фазой, разделенными мембраной:

где R-универсальная газовая постоянная, T-абсолютная температура, F- число Фарадея. Величина обычно составляет около 0,25 В, причем основная часть (0,15-0,20 В) представлена электрической составляющей . Энергия , выделяющаяся при движении протонов внутрь митохондрий по электрическому полю в сторону меньшей их концентрации (рис. 2, процесс 2), используется АТФ-синтетазой для синтеза АТФ. Т. образует, схему окислительного фосфорилирования, согласно этой концепции, можно представить в следующем виде:

Перенос электронов (дыхание) АТФ

Сопряжение  окисления и фосфорилирования через позволяет объяснить, почему окислительное фосфорилирование, в отличие от гликолитического ("субстратного") фосфорилирования, протекающего в растворе, возможно лишь в замкнутых мембранных структурах, а также, почему все воздействия, снижающие электрическое сопротивление и увеличивающие протонную проводимость мембраны, подавляют ("разобщают") окислительное фосфорилирование. Энергия , помимо синтеза АТФ, может непосредственно использоваться клеткой для других целей - транспорта метаболитов, движения (у бактерий), восстановления никотинамидных коферментов и др.

В дыхательной  цепи имеется несколько участков, которые характеризуются значительным перепадом окислительно-восстановительного потенциала и сопряжены с запасанием энергии (генерацией ). Таких участков, называемых пунктами или точками сопряжения, обычно три: НАДН: убихинон-редуктазное звено ( 0,35-0,4 В), убихинол: цитохром-c-редуктазное звено ( ~ 0,25 В) и цитохром-с-оксидазный комплекс ( ~ 0,6 В) - пункты сопряжения 1, 2 и 3 соответственно (рис. 3). Каждый из пунктов сопряжения дыхательной цепи м.б. выделен из мембраны в виде индивидуального ферментного комплекса, обладающего окислительно-восстановительной активностью. Такой комплекс, встроенный в фосфолипидную мембрану, способен функционировать как протонный насос.

 

 

Обычно для  характеристики эффективности окислительного фосфорилирования используют величины Н⁺/2е или q/2e, указывающие, сколько протонов (либо электрических зарядов) переносится через мембрану при транспорте пары электронов через данный участок дыхательной цепи, а также отношение Н⁺/АТФ, показывающее, сколько протонов нужно перенести снаружи внутрь митохондрий через АТФ-синтетазу для синтеза 1 молекулы АТФ. Величина q/2e составляет для пунктов сопряжения 1, 2 и 3 соответственно 3-4, 2 и 4. Величина Н⁺/АТФ при синтезе АТФ внутри митохондрий равна 2; однако еще один Н+ может тратиться на вынос синтезированного АТФ^4- из матрикса в цитоплазму переносчиком адениновых нуклеотидов в обмен на АДФ ^-3 . Поэтому кажущаяся величина Н⁺ / АТФ_наружн равна 3.

В организме  окислительное фосфорилирование подавляется множественными токсичными веществами, которые по месту их действия можно разделить на три группы: 1) ингибиторы дыхательные цепи, или так называемые дыхательные яды. 2) Ингибиторы АТФ-синтетазы. Наиболее распространенные ингибиторы этого класса, употребляемые в лабораторных исследованиях, антибиотик олигомицин и модификатор карбоксильных групп белка дициклогексилкарбодиимид. 3) Так называемые разобщители окислительного фосфорилирования. Они не подавляют ни перенос электронов, ни собственно фосфорилирование АДФ, но обладают способностью уменьшать величину   на мембране, благодаря чему нарушается энергетическое сопряжение между дыханием и синтезом АТФ. Разобщающее действие проявляет большое число соединений самой разнообразной химической структуры. Классические разобщители - вещества, обладающие слабыми кислотными свойствами, способные проникать через мембрану как в ионизованной (депротонированной), так и в нейтральной (протонированной) формах. К таким веществам относят, например, 1-(2-дицианометилен) гидразино-4-трифтор-метоксибензол, или карбонилцианид-n-трифторметокси-фенилгидразон, и 2,4-динитрофенол (соответствующие формулы I и II; показаны протонированная и депротонированная формы).

 

Двигаясь через мембрану в электрическом поле в ионизованной форме, разобщитель уменьшает ; возвращаясь обратно в протонированное состоянии, разобщитель понижает (рис. 4). Таким образом, такой "челночный" тип действия разобщителя приводит к уменьшению .

 

Разобщающим действием обладают также ионофоры (например, грамицидин), повышающие электропроводность мембраны в результате образования ионных каналов или вещества, разрушающие мембрану (например, детергенты).

Окислительное фосфорилирование открыто В. А. Энгельгардтом в 1930 при работе с эритроцитами птиц. В 1939 В. А. Белицер и Е. Т. Цыбакова показали, что окислительное фосфорилирование сопряжено с переносом электронов в процессе дыхания; к такому же заключению несколько позднее пришел Г. М. Калькар.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Микробиология масла. Виды порчи

 

Микробиология масла. Микрофлора масла. Сливочное масло - важнейший продукт переработки молока - изготовляется из пастеризованных сливок, в которых содержится небольшое число бактерий: от сотен до нескольких тысяч клеток в 1 мл. В основном это споровые палочки микрококки.

 В процессе изготовления масла в него попадают микроорганизмы из производственной аппаратуры, воздуха, воды, которая используется для промывки масла.

 Сливочное масло содержит  остаточную микрофлору пастеризованных  сливок, а также микрофлору, попавшую  в масло извне в процессе  его изготовления. В основном  бактерии представлены бесспоровыми  палочками и микрококками, среди  которых встречаются такие, которые  вырабатывают ферменты, расщепляющие молочный жир и белки.

 Обсемененность поверхностного  слоя блока масла выше, чем  его внутреннего слоя.

 При положительной Т=(15°С) хранения масла количество микроорганизмов в нем увеличивается.

 При низкой положительной Т=(5°С) бактерии развиваются медленнее, растут г.о. посторонние микроорганизмы, споровые и бесспоровые палочки, микрококки, дрожжи. Микроорганизмы могут развиваться лишь в плазме масла, которая представляет собой водный раствор белковых веществ, молочного сахара и солей. Плазма находится в масле в виде капелек разного размера.

 Оптимальной для длительного хранения масла является Т= -20°С, при которой в масле задерживаются микробиологические и физико-химические процессы. Большое значение для хранения масла имеет упаковка: масло, упакованное в пленку из полимерных материалов, сохраняется лучше, чем в пергаменте. При хранении масла в пленочной упаковке микрофлора его постепенно снижается, а в масле, упакованном в пергамент, сохраняется на исходном уровне.

 Скорость нарастания  микрофлоры масла при хранении  зависит от Т хранения: при хранении масла 15°С число клеток бактерий (в основном молочнокислых - (стрептококков) в 1 г уже через 5 дней достигает нескольких десятков миллионов. При более низкой Т хранения (5°С) размножение бактерий (гнилостных бактерий, микрококков, дрожжей) замедляется и число их в 1 г не превышает 10 млн. в течение всего периода хранения.

 

 Виды порчи масла. К видам порчи масла относятся штафф, прогоркание, горький вкус, нечистый запах, плесневение.

 

 Штафф выражается в изменении цвета и вкуса поверхностного слоя монолита масла, вызванного накоплением продуктов разложения жира и белков. Процесс вызывается жизнедеятельностью аэробной поверхностной микрофлоры, разлагающей жир и белок в поверхностном слое масла. Предупредить порок можно при создании неблагоприятных условий для развития бактерий: при герметичной упаковке масла и низкой температуре хранения.