Основы генетической инженерии

АО « Медицинский университет Астана»

Кафедра Молекулярной биологии и медицинской генетики

 

 

 

 

 

 

 

 

 

На Тему: Основы генетической инженерии

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Астана 2012

Содержание

Введение…………………………………………………………………….2

1. Генетическая инженерия. Понятие……………………………………….4
2. Задачи и методы генной инженерии……………………………………..4
3. Рестриктазы – основные ферменты генетической инженерии…………5
4. Понятие о векторе. Типы векторов, их конструирование………………6
5. Клонирование генов………………………………………………………8
6. Трансгеноз ……………………………………………………………….11
7. Практические результаты генной инженерии…………………………..12
8. Возможности генной инженерии……………………………………….13

Заключение………………………………………………………………16

Список использованной литературы……………………………………17

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

Генетическая инженерия –  перспективное направление современной

генетики, имеющее большое научное и практическое значение и лежащее в

основе современной биотехнологии. 

Любой ген и продукты его экспрессии (РНК и белки) стали доступны

для исследования структуры и функций; появилась возможность исследовать

гигантские геномы высших организмов и целенаправленно изменять их

структуру. В практическом отношении стало возможным направленное соз-

дание организмов с новыми  (в том числе не встречающимися в природе)

комбинациями наследственных свойств,  что трудно  (или невозможно)  сде-

лать обычными методами –  гибридизацией,  мутагенезом и др.  Основными

задачами,  стоящими перед генетической инженерией сегодня,  являются

борьба с болезнями и производство продовольствия. Методы генетической

инженерии стали незаменимыми в фармакологии. Они позволили получать

ценные лекарственные препараты,  используя живые организмы в качестве

биореакторов.  Генно-инженерные методы находят все более широкое при-

менение в медицине, став основой генотерапии (лечения генами), позволив-

шей излечивать многие ранее неизлечимые наследственные заболевания.

В работах по генетической инженерии используются как методы

классической генетики, так и самые современные более тонкие методы мо-

лекулярной генетики (такие как выделение и идентификация генов, их сек-

венирование,  картирование,  химический и ферментативный синтез,  ПЦР-

анализ, блот-гибридизация, генный нокаут, генная дактилоскопия и др.). В

пособии дается подробное описание некоторых из них. 

Генетическая инженерия, как известно, – высокотехнологичный про-

цесс, основанный на фундаментальных научных знаниях и требующий вы-

сококвалифицированных кадров и мощной научно-технической базы.  По-

этому будущим специалистам в качестве основы для проведения исследо-

ваний по генетической инженерии необходимо иметь представление об ос-

новных этапах создания трансгенных организмов,  принципах конструиро-

вания рекДНК, знать процедуры по созданию и скринингу банков генов как

источников для получения и изучения функций желаемых для переноса ге-

нов и др.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Генетическая (геннная) инженерия

 

Генетическая (геннная) инженерия – это методы получения реком-

бинантных  (гибридных)  ДНК из фрагментов геномов разных организмов,

введение их в клетку и обеспечение условий для экспрессии чужеродных

генов.  При этом можно осуществить направленное конструирование  (соз-

дание) организмов с заданными (нужными человеку) свойствами, что труд-

но (или невозможно) сделать обычными методами –  гибридизацией, мута-

генезом и др. 

Формальной датой рождения генной инженерии считают 1972 г., когда

группа П. Берга в США создали первую рекомбинантную молекулу ДНК

(рекДНК), объединившую в своем составе генетический материал из трех ис-

точников: полный геном онкогенного вируса обезьян SV40, часть генома уме-ренного бактериофага λ и гены лактозного оперона E. сoli. Сконструированная рекомбинантная молекула не была исследована функционально, т.к. у авторов этой работы возникли опасения,  что методы генетической инженерии могут привести к возникновению микроорганизмов, опасных для здоровья человека,  например,  бактерий Е.  сoli,  способных перенести онкогенные вирусы в кишечник человека. Поэтому международным научным сообществом было принято решение проводить такие исследования под строжайшим контролем со

стороны государства.

 

Задачи и методы генной инженерии

 

Задачи генной инженерии

Основные направления генетической модификации организмов:

– придание устойчивости к ядохимикатам (например, к определенным гербицидам); 

– придание устойчивости к вредителям и болезням (например, Bt-модификация);

– повышение продуктивности (например, быстрый рост трансгенного лосося);

– придание особых качеств (например, изменение химического состава).  

Методы генной инженерии

Методы генной инженерии основаны на получении фрагментов исходной ДНК и их модификации.

Для получения исходных фрагментов ДНК разных организмов используется несколько способов:

– Получение фрагментов ДНК из природного материала путем разрезания исходной ДНК с помощью специфических нуклеаз (рестриктаз).

– Прямой химический синтез ДНК, например, для создания зондов.

– Синтез комплементарной ДНК (кДНК) на матрице мРНК с использованием фермента обратной транскриптазы (ревертазы).

 

РЕСТРИКТАЗЫ – ОСНОВНЫЕ ФЕРМЕНТЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ

ИНЖЕНЕРИИ

В основе методов генной инженерии лежит способность бактериаль-

ных ферментов рестрикции (рестриктаз) расщеплять ДНК на отдельные до-

вольно короткие нуклеотидные последовательности. Естественной функци-

ей рестриктаз является защита бактерии от инфекции вирусами. Эти фер-

менты рестрицируют  (т.е.  ограничивают)  возможность размножения фаго-

вой ДНК в бактерии путем разрезания ее на части. Фермент рестрикции не

может расщеплять свою собственную  (бактериальную) ДНК,  т.к.  в сайтах

рестрикции бактериальная ДНК модифицирована метилированием, которое

осуществляется особым ферментом –  ДНК-метилазой.  В бактериальной

клетке существует система рестрикции-модификации. Определенные рест-

риктазы специфически узнают только свои «мишени», состоящие из 4–6 пн

и разрезают ДНК в середине или несколько в стороне от этой последова-

тельности, делая соответственно прямые или ступенчатые разрезы в обоих

цепях ДНК (рис. 1). В последнем случае образуются «липкие» (выступаю-

щие одноцепочечные) концы, которые благодаря комплементарности осно-

ваний могут вновь замыкаться с образованием водородных связей. То есть

концы, сформировавшиеся под действием одной и той же рестриктазы, мо-6

гут гибридизироваться между собой. Это обеспечивает возможность объе-

динения различных молекул ДНК и создание рекомбинантных (гибридных)

молекул ДНК.  Рестриктазы были названы биологическими ножами,  кото-

рыми манипулируют генные инженеры или хирурги.

Примером рестриктаз, образующих «липкие концы», являются широ-

ко используемые в генно-инженерных работах ферменты бактериального

происхождения – EcoRI (присутствует у E.coli)  и BamHI (обнаружена в

клетках Bacillus amyloliquefaciens). Например, EcoRI распознает последова-

тельность из 6 нуклеотидов (GAATTC), делая ступенчатые разрезы между

нуклеотидами G и А (рис. 1), HaeIII – узнает 4 нуклеотида (GGCC), делая

прямые разрезы и образуя «тупые» концы. Для соединения «тупых» концов

к ним ферментативным путем присоединяют  «липкие»  концы.  Ферменты

рестрикции обозначают по названию организмов, из которых они изолиро-

ваны. Используют три буквы из названия вида бактерии, например, EcoRI

из E.coli,  HindIII –  из Haemophilus influenzae,  HaeIII –  из Haemophilus

aegyptius и т.д. После трех букв курсивом следуют определенный буквен-

ный символ,  обозначающий генетическую линию или штамм,  и римская

цифра. В настоящее время известно более 400 рестриктаз,  способных рас-

щеплять ДНК в различных сайтах.

            EcoRI               HaeIII    

                                        

          C  G  A  A  T T C C A T A G G C  C G C 

          G  C  T  T  A A G G T A T C C G  G C G 

                                            

C  G            A  A  T T C C A T A G G   C  C G C

G  C  T  T  A  A            G G T A T C C   G  G C G

                                            

    «липкие» концы            «тупые» концы  

Рис. 1. Последовательность нуклеотидов, которая содержит сайты 

(сайты рестрикции), распознаваемые  различными рестриктазами.

 

Понятие о векторе. Типы векторов, их конструирование

 

Обязательной генетической конструкцией,  используемой в экспери-

ментах по генной инженерии,  является вектор.  Векторы –  это молекулы

ДНК, способные переносить включенные в них чужеродные гены в клетку,

где эти молекулы реплицируются автономно или после интеграции с гено-

мом  (хромосомой). Таким образом,  векторы используются в генной инже-

нерии для переноса трансгена от организма-донора в организм-реципиент, а

также для клонирования генов.  Однако нельзя ввести чужеродный фраг-

мент ДНК сразу в клетку эукариот или некоторых бактерий (без вектора).

Это связано с тем, что при обычном введении ДНК в клетку она, как прави-

ло, подвергается атаке ферментов, которые разрезают ее на отдельные фраг-

менты. Для того, чтобы рекДНК стала составной частью генетического ап-

парата клетки,  она должна либо встроиться в ее геном  (интегрировать в

хромосому)  и реплицироваться за его счет,  либо быть способной к авто-

номной репликации.

Вектор должен обладать следующими свойствами:

1. Способность к автономной (т.е. независимо от хромосомы реципи-

ента) репликации в клетке реципиента. Например, для репликации в клетке

бактерии вектор должен содержать сайт ori  (участок инициации реплика-

ции).  

2. Наличие сайта, в котором  возможно встраивание желаемого  фраг-

мента ДНК. Для этого вектор должен содержать один, или самое большое -

два участка (сайта рестрикции), чувствительных к определенной рестрикта-

зе, которая расщепляет вектор и позволяет встроить желаемый трансген. 

3. Наличие одного или  нескольких маркерных генов, благодаря  кото-

рым клетка-реципиент будет обладать новыми признаками, позволяющими8

отличить трансформированные клетки (т.е. содержащие рекДНК) от исход-

ных. Это могут быть селективные гены,  которые придают клеткам селек-

тивное преимущество  (устойчивость к антибиотикам,  гербицидам).  Такие

гены кодируют ферменты,  разрушающие или модифицирующие антибио-

тики,  гербициды. В этом случае трансформанты отбирают на питательных

средах с высоким содержанием этих веществ. Например, в присутствии ге-

на лактомазы бактериальная клетка приобретает устойчивость к пеницил-

лину и на среде с этим антибиотиком образует клон (несущий данный ген),

тогда как обычные клетки (без этого гена) на данной среде погибают. В ка-

честве маркерных используют и так называемые репортерные гены,  экс-