Основы генетической инженерии

прессия которых не дает селективных преимуществ,  но продукты генов

удобны для тестирования, например, по изменению окраски. Так, ген GFP

контролирует синтез зеленого флюоресцирующего белка из медузы.  При

облучении трансгенных растений, содержащих этот белок, УФ-лучами по-

является зеленое свечение. Гены luxA и luxB выделяют из ДНК светлячков.

Они контролируют синтез люциферазы, которая обеспечивает переход лю-

цефиринов из окисленной формы в основную, что и обеспечивает свечение

трансгенных растений, накапливающих этот белок. Широко используемым

в настоящее время репортерным геном является ген β-глюкоронидазы

(GUS). Трансгенные клетки, экспрессирующие этот ген, при помещении их

на специфический субстрат окрашиваются в голубой цвет.

4. Кроме того, чтобы чужеродный  ген экспрессировался, необходимо

его поместить под соответствующий промотор.  У эукариотических орга-

низмов механизм регуляции транскрипции более сложный, чем у эукариот.

Регуляторные последовательности эукариотических генов отличаются от

прокариотических, и бактериальная РНК-полимераза не узнает их. Поэтому

для экспрессии эукариотических генов в клетках прокариот нужно,  чтобы

гены находились под контролем бактериального промотора (т.е. промотора

клетки-хозяина). В качестве промотора широко используется промотор гена

β-лактомазы (ген устойчивости к ампициллину), локализованного в векторе

рBR322, lac-промотор E. coli и др.

То есть создается целая генетическая конструкция, в состав которой,

помимо трансгена,  вводятся маркерные гены и соответствующие регуля-

торные последовательности.

В качестве векторных молекул могут быть использованы плазмиды

бактерий или дрожжей (простых эукариотических организмов), ДНК бакте-

риофагов или вирусов, искусственные хромосомы дрожжей (YAK) и бакте-

рий (BAK). Созданы также гибридные (искусственные) векторы – космиды,

объединяющие преимущества плазмид и фагов.

Челночные векторы –  это векторы  (сконструированные на основе

плазмидной ДНК), способные реплицироваться в клетках двух и более ор-

ганизмов.  Например,  плазмида YEp24 способна размножаться в клетках

дрожжей и E. coli. В этом случае векторы имеют специфические нуклео-

тидные последовательности  (специфичные для дрожжей и E. coli),  позво-

ляющие реплицироваться или в бактерии,  или в дрожжевой клетке. С по-

мощью челночного вектора удалось ввести гены лейкоцитарного интерфе-

рона человека в клетки дрожжей. Сконструирован штамм дрожжей,  кото-

рый выделяет в культуральную среду почти чистые α-, β- и γ-интерфероны.

Интерферон – ценный лекарственный препарат, широко используемый для

борьбы с вирусными инфекциями и другими заболеваниями, включая зло-

качественные опухоли. 

Типичная схема опыта по генетической инженерии (конструирование рекДНК) включает следующие этапы.

1, 2.  Для конструирования  рекомбинантной ДНК  (рекДНК)  вектор-

ную ДНК (например, плазмиду) и чужеродную ДНК, содержащую интере-

сующий нас ген (трансген), разрезают одной и той же рестриктазой. Обра-

зуются одинаковые  «липкие»  концы  (рис. 5).  К генам,  синтезированным

химическим путем или полученным по матрице их мРНК,  такие «липкие»

концы можно пришить искусственно. 

3.  Смешивание различных  по происхождению фрагментов  ДНК и

сшивание их ДНК-лигазой.  Липкие концы чужеродной ДНК и плазмиды

взаимодействуют друг с другом,  образуя комплементарные пары основа-

ний.  Происходит гибридизация векторной и чужеродной ДНК. «Липкие»

концы замыкаются с помощью водородных связей, а ковалентные сшивают

с помощью фермента ДНК-лигазы.

4.  Генетическая трансформация,  т.е.  перенос и включение рекДНК,

содержащей трансген,  в клетки реципиента  (например, E. coli).  Плазмида,

встроенная в бактерию, ведет себя как вектор (переносчик) нового гена, ко-

торый реплицируется в каждом новом поколении.

5. Молекулярная селекция  –  отбор трансформантов,  т.е.  клонов,  не-

сущих рекДНК. В процессе генетической трансформации E. coli могут об-

разоваться 3  типа клеток:  не содержащие пламиду,  содержащие плазмиду

без встройки  (без рекДНК),  содержащие плазмиду с рекДНК. Для отбора

трансформантов среди нетрансформированных клеток используют различ-13

ные маркерные гены,  которые находятся в векторной молекуле наряду с

трансгеном. 

 

Клонирование генов

 

Клонирование генов проводят с целью получения того или иного

фрагмента ДНК в большом количестве.  Этот процесс необходим для полу-

чения многочисленных копий желаемых генов.  Клонирование ДНК воз-

можно благодаря способности бактериальных плазмид и фагов продолжать

нормальное функционирование после встраивания в их геном чужеродной

ДНК. Поскольку встроенные в геном чужеродные последовательности ДНК

не влияют на свойства химерных штаммов бактерий,  практически любая

последовательность ДНК может быть клонирована таким образом. Для кло-

нирования плазмиду,  содержащую рекДНК,  вводят в клетки бактерии (на-

пример, E. coli) или дрожжей, где происходит ее многократная репликация. 

Для клонирования небольших фрагментов ДНК используют плазмиды, фа-

говые ДНК, а для крупных – космиды и искусственные хромосомы. Клони-

рование рекомбинантных молекул с генами человека или животных в клет-

ках бактерий дает возможность в условиях микробиологического синтеза

получать большое количество нужных белков. Так, искусственно синтези-

рованный человеческий ген инсулина введен в бактерию, что дало возмож-

ность получать человеческий инсулин (гормон, широко используемый в ме-

дицине при лечении сахарного диабета)  в промышленных количествах.

Весь процесс получения бактерий, называемый клонированием, состоит из последовательных стадий:

1.  Рестрикция – разрезание ДНК человека рестриктазой на множество различных фрагментов, но с одинаковыми «липкими» концами. Такие же концы получают при разрезании плазмидной ДНК той же рестриктазой.

2.  Лигитирование – включение фрагментов ДНК человека в плазмиды благодаря «сшиванию липких концов» ферментом лигазой.

3.  Трансформация – введение рекомбинантных плазмид в бактериальные клетки, обработанные специальным образом – так, чтобы они на короткое время стали проницаемыми для макромолекул. Однако плазмиды проникают лишь в часть обработанных бактерий. Трансформированные бактерии вместе с плазмидой приобретают устойчивость к определенному антибиотику. Это позволяет их отделить от нетрансформированных бактерий, погибающих на среде, содержащей этот антибиотик. Для этого бактерии высеивают на питательную среду, предварительно разведя так, чтобы при рассеве клетки находились на значительном расстоянии друг от друга. Каждая из трансформированных бактерий размножается и образует колонию из многих тысяч потомков – клон.

4.  Скрининг – отбор среди клонов тех бактерий, которые несут нужный ген человека. Для этого все бактериальные колонии накрывают специальным фильтром. Когда его снимают, на нем остается отпечаток колоний, так как часть клеток из каждого клона прилипает к фильтру. Затем проводят молекулярную гибридизацию. Фильтры погружают в раствор с радиоактивно меченым зондом. Зонд – это полинуклеотид комплементарной части искомого гена. Он гибридизуется лишь с теми рекомбинантными плазмидами, которые содержат нужный ген. После гибридизации на фильтр в темноте накладывают рентгеновскую фотопленку и через несколько часов ее проявляют. Положение засвеченных участков на пленке позволяет найти среди множества клонов трансформированных бактерий те, которые имеют плазмиды с нужным геном.

Не всегда удается вырезать нужный ген с помощью рестриктаз. Поэтому в ряде случаев процесс клонирования начинают с целенаправленного получения нужного гена. Для этого из клеток человека выделяют и-РНК, являющуюся транскрипционной копией этого гена, и с помощью фермента – обратной транскриптазы синтезируют комплементарную ей цепь ДНК. Затем и-РНК, служившая матрицей при синтезе ДНК, уничтожается специальным ферментом, способным гидролизовать цепь РНК, спаренную с цепью ДНК. Оставшаяся цепь ДНК служит матрицей для синтеза обратной транскриптазой, комплетентарной второй цепи ДНК.

Получившаяся двойная спираль ДНК носит название к-ДНК (комплементарная ДНК). Она соответствует гену, с которого была считана и-РНК, запущенная в систему с обратной транскриптазой. Такая к-ДНК встраивается в плазмиду, которой трансформируют бактерии и получают клоны, содержащие только выбранные гены человека.

Методы переноса генов в клетки различных организмов

Чтобы осуществить перенос генов, необходимо выполнить следующие операции:

· Выделение из клеток бактерий, животных или растений тех генов, которые намечены для переноса.

· Создание специальных генетических конструкций, в составе которых намеченные гены будут внедряться в геном другого вида.

· Внедрение генетических конструкций сначала в клетку, а затем в геном другого вида и выращивание измененных клеток в целые организмы.

 

Известны многочисленные методы,  с помощью которых можно вне-

дрить чужеродную ДНК в геном различных организмов.

В качестве реципиентов, в геном которых встраиваются чужеродные

гены,  используют клетки культуры,  эмбриональные клетки млекопитаю-

щих, некоторых растений, дрозофилы, пронуклеусы млекопитающих, у рас-

тений –  протопласты,  изолированные клетки и ткани, микроспоры,  незре-

лые зиготические зародыши, проростки. Трансформация экзогенной   ДНК

может осуществляться либо в культуре клеток (in vitro = ex vivo), либо не-

посредственно в организме (in vivo) с использованием следующих методов.

– Микроинъекция. С помощью тонких микроигл и микроманипулято-

ра в клетку или прямо в ядро вводится векторная ДНК с включенным в нее

трансгеном. С помощью микроинъекций осуществляется трансформация у

дрозофилы, растений.

– Электропорация. Растительные протопласты или животные клетки

обрабатывают импульсами электрического поля высокого напряжения, что

обратимо увеличивает проницаемость биомембран. Через образующиеся на

короткое время поры чужеродная ДНК проникает в клетку.

– Перенос ДНК в составе липосом. Липосомы – это искусственно соз-

данные сферические образования,  оболочка которых состоит из фосфоли-

пидов. Липосомы, содержащие внутри трансформирующую ДНК, способны

непосредственно сливаться с мембраной клетки или поглощаться клетками

в результате процесса, подобного эндоцитозу. В клетке происходит разру-

шение оболочки липосом и высвобождение рекДНК. Это один из методов,

который используется для защиты трансформирующего генетического ма-

териала от разрушительного действия нуклеаз, присутствующих вне клеток.

Метод применяется для введения нуклеиновых кислот в культивируемые

животные клетки, растительные протопласты. 15

– Бомбардировка микропулями (баллистическая трансформация). Это

один из самых эффективных методов трансформации однодольных и хвой-

ных растений  (в которые не удается ввести чужеродную ДНК с помощью

агробактерий), а также трансформации животных клеток. Таким путем про-

водят генотерапию (т.е. исправление наследственных дефектов путем введе-

ния в геном полноценных генов)  у животных и человека.  Для  «обстрела»

тканей используются частицы из золота или вольфрама размером 0,6–3 мкм,

на которые наносится ДНК вектора, содержащий трансген. Этими частица-

ми («микропулями») заряжают «генные» пушки. Микропули разгоняются в

установке под действием электрического разряда или под давлением газа