Получение трансгенных растений и животных

Получение трансгенных растений и  животных.

 

Генно-инженерные методы, в частности  технология рекомбинантных ДНК, позволяют  создавать новые генотипы и, следовательно, новые формы растений гораздо  быстрее, чем классические методы селекции. Кроме того, появляется возможность целенаправленного изменения генотипа — трансформации — благодаря введению определенных генов. '

Проблемы выращивания сельскохозяйственных растений связаны с перспективой ввода в них генов устойчивости к стрессовым факторам, фитопатогенам, гербицидам и пестицидам, генов скороспелости, а также с расширением круга культурных расте ний, способных к симбиотической фиксации азота и т.д.

Генетическая трансформация заключается  главным образом в переносе чужеродных или модифицированных генов в эукариотические клетки. Можно вводить гены в клетки прокариот, но этот перенос осуществляется не для трансформации, а в целях увеличения экспрессии чужеродных генов, их клонирования. В клетках растений также возможна экспрессия генов, перенесенных не только от других растений, но и от микроорганизмов и даже от животных.

Получение растений с новыми свойствами из трансформированных клеток (регенерация) возможно благодаря их свойству то- типотентности, т.е. способности развиваться в целое растение.

Однако возможности генной инженерии растений ограничиваются рядом причин. Во-первых, геном растений изучен хуже, чем геном млекопитающих. Это значит, что определение и выделение искомых генов — задача очень трудная. Во-вторых, не для всех растений удается подобрать условия регенерации. Стабильно получают растения-регенеранты из протопластов картофеля, люцерны, томатов, моркови, табака, капусты и др. Регенерацию злаков из их клеток пока не всегда удается воспроизвести. Наконец, одна из главных лимитирующих причин — размер гетерологичной ДНК (не более 35 кб для агробактериальной и немного больше для баллистической трансформации), которую можно было бы эффективно вводить в геном растения. Не так давно была сделана удачная попытка использовать при трансформации пыльцу в качестве супервектора, что позволяет исключить появление химерных растений (В. А. Аветисов, Ю. В.Давыдова и др., 1999). Имеются сообщения об использовании искусственной бактериальной хромосомы в качестве вектора для трансформации, которая позволяет переносить значительные фрагменты ДНК, вводить кассеты генов, кодирующие множественные ступени биохимических процессов. Это открывает такие огромные перспективы, что первостепенными становятся вопросы экологической безопасности.

Биотехнология и, в частности, генная инженерия подошли к той ступени развития, когда прежде всего приходится думать о возможных последствиях эксперимента, об использовании полученных знаний.

Получение трансгенных растений

Перенос генов в растительные клетки, так же как в клетки животных, и их встраивание в геном растений (трансформация) осуществляются главным образом благодаря специфическим структурам — векторам.

Векторы на основе Ti-плазмид. Некоторые виды агробактерий (Agrobacteria) могут заражать двудольные растения, вызывая образование опухолей — корончатых галлов. Одним из самых сильных индукторов опухолей служит почвенная бактерия A. tumefaciens. Способность этой бактерии к образованию опухоли связана с большой внехромосомной плазмидой, получившей название Ti-плазмида (от ангд. tumor inducing— индуцирующие опухоль). Ti-пласмиды — это естественные векторы для генов, обладающие всеми функциями, необходимыми для переноса, стабильного в ключения и экспрессии генетической информации в растениях. Они имеют широкий круг хозяев. В бактериальных клетках Ti-плазмиды реплицируются автономно. Эти плазмиды различаются по типу кодируемых опинов — белков, которые используются бактериями в качестве источников азота и углерода. Обычно встречаются плазмиды, кодирующие два типа опинов: либо октопин (октопи новая плазмида), либо нопалин (нопалиновая плазмида).

После заражения часть Ti-плазмиды встречается в хромосомах клеток растения-хозяина. Следовательно, A. tumefaciens встраивает часть своего генома в ДНК растительной клетки и заставляет eе таким способом изменять метаболизм, синтезируя вещества, необходимые для бактерий. Именно это свойство A. tumefaciens и послужило поводом для создания на основе Ti-плазмиды вектора, доставляющего необходимые гены в клетку.

Участок Ti-плазмиды, встречающийся в хромосомах растительных клеток, называется Т-областью в бактерии и Т-ДНК в клетках растений. Т-область включает примерно 10 % Ti-плазмиды и содержит гены, отвечающие за индукцию опухоли, синтез опинов и подавление дифференцировки (гормоннезависимый рост клеток). Важно отметить, что все гены, ответственные за перенос и интеграцию генов Т-области, находятся не в ней самой, а рядом — в области вирулентности — vir-области (рис. 5.17).

Т-области ограничены прямыми повторяющимися последовательностями, и любая ДНК, вставленная между этими повторами, будет принята за Т-область и перенесена в растительную клетку.

Недостаток этих плазмид состоит  в том, что некоторые гены находящиеся  в Т-ДНК, заставляют расти клетки растений незави симо от гормонов, вносимых в питательную среду, на которой культивируются данные клетки. В связи с этим очень трудно регенерировать нормальное растение и клеток, содержащих полную последовательность Т-ДНК. Другой недостаток — большие paзмеры Ti-плазмиды, из-за которых затруднены какие-либо манипуляции с ней, поэтому вставить ген в плазмиду традиционными методами невозможно.

Т-область

 

 

 

vir- область

 

 

 

 

 

Рис. 5.17. Взаимное расположение Т- и vir-областей в Ti-плазмиде

 

 

 

В настоящее время конструируются производные Ti-плазмиды, в которых оставляют регуляторный участок Т-области а вместо ее структурных генов вшивают структурную часть гена, который надо ввести в растение. Такие гены с позиции их регенерации безвредны для растений.

Существуют и другие бактерии (A. rhizogenes), вызывающие усиленное образование корешков при заражении растений. За этот процесс ответственны содержащиеся в них так называемые Ri- плазмиды (от англ. root inducing — индуцирующий корни). Ri-плазмиды выгодно отличаются от Ti-плазмид тем, что они служат естественными безвредными векторами, так как трансформированные с их помощью растительные клетки сохраняют способность к морфогенезу и к регенерации здоровых растений. В связи с этим Ri-плазмиды в данный момент рассматриваются как более перспективные векторы.

 

Промежуточный и бинарный векторы. Эти векторы конструируются на основе Ti-плазмид. Промежуточный вектор получают путем ряда сложных операций. Сначала Т-область с помощью рестриктаз вырезают из плазмиды, вставляют в вектор для клонирования в клетке Е. coli и размножают. Затем внутрь Т-области встраивают чужеродный ген и вновь размножают. Полученную рекомбинантную плазмиду вводят в клетки A. tumefaciens, несущие полную Ti-плазмиду. В результате двойного кроссинговера между гомологичными участками Т-область рекомбинантной плазмиды, содержащая чужеродный ген, включается в Ti-плазмиду клетки хозяина, заместив в ней нормальную Т-область. Наконец, бактериями, имеющими Ti-плазмиду со встроенными генами, заражают растения, где эти гены встраиваются в геном растительной клетки.

Бинарные векторы представляют собой бактерии, содержащие две разные Ti-плазмиды. Одна из них несет vir-область и обеспечивает интеграцию в геном растительной клетки Т-области, содержащей любые гены другой плазмиды. В этом случае двойной кроссинговер не требуется.

Однако полученные в результате заражения бактериями растительные клетки не способны к регенерации, так как у них подавлена дифференцировка. Трансформированные растительные клетки смогут дифференцироваться, если в гены, блокирующие дифференцировку, ввести мутации или вырезать их из Т-ДНК.

Векторы на основе ДНК-содержащих вирусов растений. Вирусы можно рассматривать как разновидности чужеродной нуклеиновой кислоты, которые реплицируются и экспрессируются в клетках растений. Подавляющее большинство фитовирусов в качестве носителя генетической информации содержат РНК. Только 1 — 2 % вирусов, инфицирующих растения, относятся к ДНК-содержащим. Именно эти вирусы удобны для использования в технологии Рекомбинантных ДНК, а также в качестве векторов.

ДНК-содержащие вирусы могут включать одноцепочечную или двухцепочечную ДНК. В качестве представителей первой группы можно назвать вирус золотистой мозаики фасоли (ВЗМФ| или вирус полосатости кукурузы. Наиболее изученный представитель группы вирусов с двухцепечечной ДНК — вирус мозаики цветной капусты (ВМЦК), поражающий в основном растения семейства крестоцветные.

Обычно фитовирусы реплицируются  с образованием большого числа копий  молекул нуклеиновых кислот — 10⁶ и более молекул на зараженную клетку. Например, при репликации вируса табачной мозаики образуется 10⁷ молекул нуклеиновых кислот (РНК) на клетку. Поэтому фитовирусы представляют собой очень эффективные средства для получения хорошей экспрессии чужеродного гена. Кроме высокой копийности вирусной нуклеиновой кислоты вирусные векторные системы имеют еще ряд преимуществ: малый размер генома (возможность легкой манипуляций вирусной ДНК) и сильные промоторы, обеспечивающие эффективную экспрессию чужеродных генов.

Однако вирусы в качестве векторов обладают и существенными недостатками: имеют небольшую емкость, патогенны и неспособны встраиваться в хромосомы хозяина. Небольшую емкость можно увеличить, если инфицировать вирусом (например, ВМЦК) растительные протопласты, а не клетки. В этом случае инфекция не передается от клетки к клетке, нет необходимости в упаковке ДНК в вирусные частицы.

Следовательно, часть вирусного  генома, ответственная за упаковку в вирусные частицы, может быть удалена и замещена дополнительной чужеродной ДНК. Другой недостаток — отсутствие способности встраиваться в геном растительной клетки — удается обойти (по крайней мере для ВМЦК) благодаря специальному методическому приему — агроинфекции. Для этого геном ВМЦ1 встраивают в Т-область Ti-плазмиды и в ее составе интегрируют ядерный геном различных растений.

Методы прямого переноса генов в растение. Эти методы возникли благодаря появлению специфического объекта — изолированных протопластов, т. е. клеток, лишенных целлюлозной стенки.

Методы прямого переноса генов довольно многочисленны:

1. Трансформация растительных протопластов. Осуществляете благодаря комбинации методик кальциевой преципитации ДНК и слияния протопластов. Для трансформации может быть использован практически любой ДНК-вектор. Донорная ДНК может не содержать специальных биологических сигналов (vir-областей, пограничных областей Т-ДНК).
2. Культуру протопластов на начальной стадии ее роста заражают агробактериями, которые используют в качестве векторов.
3. Микроинъекции ДНК. Аналогичен методу микроинъекций животных клеток. Этот метод можно рассматривать как наиболее универсальный. Эффективность трансформации растительных клеток — 10 — 20% независимо от типа вектора. Трансформация не видоспецифична, возможен перенос генов в любое растение.
4. Электропорация. Метод основан на повышении проницаемости биомембран за счет действия импульсов высокого напряжения. В результате молекулы ДНК проникают в клетки через поры в клеточной мембране.
5. Упаковка в липосомы. Это один из методов, позволяющих защитить экзогенный генетический материал от разрушения нуклеазами растительной клетки. Липосомы — сферические тельца, оболочки которых образованы фосфолипидами.

Метод биологической баллистики. Это один из самых эффективных методов трансформации однодольных растений. Исходный материал для трансформации — суспензионная культура, каллусная ткань или 4—5-дневные культивируемые незрелые зародыши однодольных.

Метод основан на напылении ДНК-вектора  на мельчайшие частички вольфрама, которыми затем бомбардируют клетки. Бомбардировка осуществляется с помощью биолистической пушки за счет перепада давления. Часть клеток гибнет, а выжившие клетки трансформируются, затем их культивируют и используют для регенерации растений.

Клонирование в клетках животных. Проблема введения генов в клетки млекопитающих очень важна для исследования функционирования генов высших эукариот.

Предварительно клонированные  гены вводят в клетку животных различными путями. Суть одного из них состоит в трансформации клеток требуемым геном, соединенным с одним из генов, для которых осуществляется селекция. Для идентификации и последующего размножения клеток, содержащих интегрированную ДНК, был разработан метод, получивший название метода маркера. Примером может служить метод получения клеток, дефектных по синтезу фермента тимидинкиназы (ТК~-клетки). Такие клетки трансформировались фрагментами ДНК вируса герпеса (HSV), содержащего ген фермента ТК, и после трансформации они приобретали способность к синтезу фермента на селективной среде, т.е. становились ТК⁺-клетками. Клетки ТК⁺ легко отличаются от клеток ТК~, поскольку способны расти на средах с аминоптерином (ингибитор, блокирующий определенные стадии биосинтеза нуклеотидов), гипоксантином и тимидином. Следовательно, в данном случае для трансформации клеток животных были использованы гибриды бактериальных плазмид с геном ТК из вируса герпеса. Для этого предварительно проводили клонирование и идентификацию генов в клетках Е. coli и затем полученная рекомбинантная плазмида вводилась в ТК~-клетки. Анализ методом бдот-гибридизации подтвердил, что выжившие клетки содержали интегрированный в геном ТК-ген вируса герпеса.

Селективные маркеры дают возможность  вводить в клетки млекопитающих  любой ген, заранее лигированный с клонированным селективным маркером.

В последние годы сконструировано большое количество так называемых челночных векторов и их рекомбинантных производных, способных к репликации в животной и бактериальной клетках, экспрессирующие клонируемый ген в животной клетке. К числу таких векторов можно отнести векторы из плазмиды pBR322 и интактного района транскрипции ДНК SW-40. Геном SW-40 представляет собой циклическую ДНК длиной 5243 п.о. Однако в вирусах животных размеры несущественных областей малы и в них нельзя внедрить большие фрагменты чужеродной ДНК, например ген дигидрофолатредуктазы мыши размером 42 kb. В большинстве случаев чужеродная ДНК замещает существенные гены, в результате чего рекомбинантные вирусы утрачивают способность к репликации. Для ее функционирования используют «вирусы- помощники», синтезирующие продукты недостающих генов, за счет которых и существует рекомбинантный вирус. Обычно опухолевые вирусы (в том числе SV-40) внедряют свою ДНК в хромосому клетки-хозяина и тем самым убивают ее при своем размножении. Обычно вирус бычьей папилломы в трансформированных клетках существует в виде эписомы (=100 копий на клетку) и используется в качестве основы для конструирования эписомных векторов. Одна из важнейших задач генной инженерии — разработка технологий по созданию векторов, подобных плазмидам, не убивающим клетку-хозяина и эффективно экспрессирующим клонируемый ген в животной клетке.