Получение трансгенных растений и животных

Представляют немаловажный интерес микроинъекции ДНК непосредственно в ядро клетки. Так, плазмиды, содержащие фрагмент вируса герпеса с геном тимидинкиназы, и плазмиды pBR322 были инъецированы в ТК-клетки, при этом ТК-ген проник в ядра и нормально в них реплицировался.

Трансформация соматических клеток млекопитающих  открывает возможность для изучения механизмов регуляции экспрессии генов и целенаправленно модифицировать генетический аппарат клетки  животных, в том числе и человека. Культуры клеток млекопитающих могут быть эффективным источником выделения ряда вирусных антигенов с целью получения вакцин для животных и человека.

В настоящее время разработаны  способы введения генов в эмбриональные  клетки млекопитающих, мух и некоторых  растений с целью изменения свойств  организма, таких, как скорость роста, устойчивость к заболеваниям и внешним воздействиям. Подобного рода работы были начаты с довольно крупными яйцами амфибий, а затем продолжены с яйцеклетками и эмбрионами мыши.

Микроинъекцию клонированных генов  проводят в один или оба пронуклеуса  только что оплодотворенной яйцеклетки мыши. После инъекции яйцеклетку немедленно имплантируют в яйцевод приемной матери или дают возможность развиваться в культуре до стадии бластоцисты после чего имплантируют в матку. Таким образом были инъецированы гены интерферона и инсулина человека ген глобина кролика ген тимидинкиназного вируса герпеса и к ДНК вируса лейкемии мышей. Выживает обычно от  10 до 30% яйцеклеток, а доля мышей родившихся из трансформированных яйцеклеток составляет от нескольких до 40%.

Выяснено что уровень экспрессии чужеродного гена зависит от места интеграции ДНК с хромосомами, от дифференцировки тканей.

Несмотря на определенные успехи в  области интеграции чужеродных генов  в эмбриональные клетки животных, до сих пор не удалось встроить чужеродную ДНК в заданный участок  хромосомы,вытеснить ген и заменить его новой нуклеотидной последовательностью, подчинить новый ген системе регуляции организма. Преодоление этих трудностей позволит успешно осуществлять генотерапию человека – лечение нескольких десятков генетических заболеваний, обусловленных отсутсвием или дефектами генов.

Использование генетической инженерии  в животноводстве

Применение методов генной инженерии  в животноводстве открывает перспективу  изменения ряда свойств организма: повышения продуктивности, резистентности к заболеваниям, увеличение скорости роста, улучшение качества продукции и др. Животных, несущих в своем геноме рекомбинантный (чужеродный) ген, принято называть трансгенными, а ген, интегрированный в геном реципиента – трансгеном. Продукт этого гена (белок) является трансгенным. Благодаря переносу генов у трансгенных животных возникают новые качества, а дальнейшая селекция позволяет закрепить их в потомстве и создавать трансгенные линии.

Получение трансгенных животных предусматривает  ряд этапов: приготовление раствора ДНК для микроинъекции, извлечение эмбрионов из донорных организмов, У родившихся потомков исследуют экспрессию трансгена на уровне транскрипции и трансляции. Трансгенное потомство получают путем использования традиционных методов разведения животных. Следует отметить, что от приготовления инъекционного раствора ДНК (его чистоты, концентрации) во многом зависит эффективность получения трансгенных животных. Обычно гены транспортируют на ранних стадиях развития животного (в большинстве случаев на стадии зиготы и двухклеточных эмбрионов). Для трансформаций генов в геном животного используют следующие приемы: микроинъекцию ДНК в пронуклеус зигот или в каждый бластомер y двухклеточного эмбриона; введение ДНК с помощью ретровирусных векторов; получение трансгенных химер из генетически, трансформированных клеток и эмбрионов. В настоящее время наиболее распространенный метод — микроинъекция ДНК. Ее осуществляют с помощью специальной пипетки (внутренний диаметр ее около 1 мкм), а количество инъецированного раствору ДНК составляет 1 — 2 пкл. После инъекции ДНК эмбрионы культивируют до момента пересадки реципиентам. Следует отметить, что микроинъекция эмбрионов сельскохозяйственных животный значительно сложнее, чем микроинъекция эмбрионов мышей и кроликов. 

После небольшого культивирования in vitro проинъецированные эмбрионы переносят в яйцеводы (хирургическим путем) реципиентов. Каждому реципиенту мыши, кролика и свиньи обычно пересаживают 20 — 30 инъецированных зигот, причем у свиней все эмбрионы трансплантируют в один яйцевод; у мышей и кроликов — раздельно по яйцеводам, а у овец, коз и крупного рогатого скота — по 2 —4 эмбриона каждому реципиенту. Используй методы блот-анализа, дот-блот-анализа и ПЦР, можно получить вполне надежные доказательства интеграции и экспрессии ДНК у трансгенных животных. С этой целью используют ядросодержащие клетки тканей или внутренних жидкостей реципиента, из которых выделяют ДНК. 

Для исследования у трансгенных  животных выделяют РНК а тех тканей, в которых предполагается наиболее высокий уровень экспрессии. Качественный и количественный анализы экзогенных белков позволяют судить об уровне трансляции инъецированного генного материала.

Генетический анализ родившихся трансгенных  животных и полученного от них потомства показал, что, несмотря на инъекцию ДНК на ранних стадиях, в трансгенных линиях могут появ ляться так называемые мозаики. К мозаикам относят животных происходящих из одной зиготы, но имеющих разные генотипы. Помимо клеточных линий, содержащих трансген, они имеют еще и нетрансгенные клеточные линии. Подсчитано, что около 30% первичных трансгенных животных, полученных методом микроинъекции ДНК, — мозаики, что затрудняет создание чистых трансгенных линий животных. Этим объясняется тот факт, что трансген не передается потомству с ожидаемой в соответствии с закона» Менделя частотой 50 %. Часть мозаиков вообще не может дать начало трансгенным линиям, так как у них отсутствует передача трансгена по наследству.

Одна из важнейших задач сельскохозяйственной биотехнологии — выведение трансгенных животных с улучшенной продуктивностью и более высоким качеством продукции, резистентностью к болезням, а также создание так называемых животных-биореакторов -продуцентов ценных биологически активных веществ. Каковы же успехи биотехнологии в этом направлении? С генетической точки зрения особый интерес представляют гены, кодирующие белки каскада гормона роста: непосредственно гормон роста (ГР), рилизинг-фактор гормона роста (РФ) и инсулинпо- добный фактор ГР (ИФГР).

В конце 70-х годов XX в. на основе технологии рекомбинантной ДНК получили гормон роста микробного происхождения. Было показано, то ГР оказывает такое же стимулирующее действие на лактацию и рост животного, как и гипофизарный ГР. Гормон роста, полученный с помощью методов генетической инженерии, при крупномасштабном применении вызывал увеличение удоев на 23 — 31 % при дозе 13 мг в день. Разработаны формы препарата пролонгированного действия, позволяющие использовать его один раз в две недели и даже в месяц. При ежедневной инъекции ГР молодняку крупного рогатого скота, свиней и овец удалось увеличить суточные привесы на 20 — 30% при значительном сокращении расхода кормов на единицу прироста. У молодняка свиней с ускорением роста увеличивалось содержание белка и уменьшалось содержание жира в тканях, что повышало качество мясопродуктов.

Первые трансгенные мыши с геном  ГР были получены в 1982 г. У них отмечалось повышение скорости роста и увеличение конечной живой массы. Однако у трансгенных свиней с геном ГР (1989) увеличение роста не наблюдалось.

По данным Л. К.Эрнста (1996), у трансгенных  свиней с геном рилизинг-фактора  гормона роста (РФ ГР) конечная живая  масса была на 15,7 % выше по сравнению  с контрольными животными. У потомства  трансгенных свиней, получавших модифицированный кормовой рацион с повышенным содержанием белка (18% сырого протеина) и с дополнительным количеством лизина, отмечались более высокие среднесуточные привесы (на 16,5 %).

У трансгенных овец с генами ГР и РФ ГР, несмотря на повышенный уровень ГР, скорость роста не увеличивалась. Вместе с тем, по данным большинства исследователей, у трансгенных свиней наряду с повышением содержания белка наблюдалось двукратное уменьшение толщины шпика (7 — 8 мм у трансгенных против 18 —20 мм у контрольных животных); аналогичные показатели отмечены у трансгенных овец (25 — 30 % жира у контрольных животных против 5 —7% у трансгенных овец).

Рассматривается возможность уменьшения лактозы в молоке путем создания животных, у которых присутствует специфически для молочной железы промотор, соединенный с геном фермента B-галактозидазы, катализирующей распад лактозы. Молоко таких животных, не содержащее лактозы, могут использовать люди, которых не синтезируется b-галактозидаза. Ведутся работы по введению генных конструкций в организм трансгенных животных вырабатывающих антитела, предотвращающие маститы.

Другая важная задача — выведение  трансгенных животных устойчивых к заболеваниям. Потери в животноводстве, вызванные различными болезнями, достаточно велики, поэтому все более важное значение приобретает селекция животных по резистентности к болезням, вызываемых микроорганизмами, вирусами, паразитами и токсинами. Пока результаты селекции на устойчивость животных к различным заболеваниям невелики, но обнадеживающи. В частности, созданы популяции крупного рогатого скота с примесью крови зебу, устойчивые к некоторым кровепаразитарным заболеваниям. Установлено, что защитные механизмы от инфекционных заболеваний обусловлены либо препятствием вторжению возбудителя, либо изменением рецепторов. Вторженй возбудителей, равно как и их размножению, препятствуют иммунная система организма и экспрессия генов главного комплекса гистосовместимости. Одним из примеров гена резистентности у мышей служит ген Мх. Этот ген, обнаруженный в модифицированной форме у всех видов млекопитающих, вырабатывает у Мх⁺-мышей иммунитет к вирусу гриппа А. Ген Мх⁺ был выделен, клонирован и использован для получения трансгенных свиней, экспрессирующих ген Мх на уровне РНК. Однако данные о трансляции Мх-протеина, обусловливающего устойчивость трансгенных свиней к вирусу гриппа А, пока не получены. Ведутся исследования в целях получения трансгенных животных, резистентных к маститу за счет повышения содержания белка лакп ферина в тканях молочной железы. На культуре клеток из почек трансгенных кроликов было показано, что клеточные линии, содержащие трансгенную антисмысловую РНК, имели резистен ность против аденовируса Н5 (Ad₅) более высокую на 90 — 98% по сравнению с контрольными линиями клеток. Л.К.Эрнст продемонстрировал также устойчивость трансгенных животных с геном антисмысловой РНК к лейкозу крупного рогатого скота, заражению вирусом лейкоза.

Показана возможность конструирования  системы внутриклеточной иммунизации против инфекционных вирусов с участием мутационных форм эндогенных вирусных белков, защищающих от соответствующих вирусов. Так, получены трансгенные куры, устойчивые к лейкозу, у которых в клетках присутствовал белок вирусной оболочки.

Одна из важнейших задач стратегии  использования трансгенных животных в медицине – получение биологически активных соединений за счет включения в клетки организма генов, вызывающие у них синтез новых белков.

Трансгенные животные как продуценты ценных биологически активных белков и гормонов имеют ряд преимуществ  перед микроорганизмами и клеточными системами. Новые белки могут быть модифицированы их активность сравнима с активностью протеинов.

Один из основных этапов получения  получения трансгенных животных – идентификация промотера направляющего  экспрессию генов.

Трансгенные животные легко размножаются, содержание их сравнительно дешево, что делает этих вотных хорошими продуцентами разнообразных белков с низкое стоимостью. В России группой ученых под руководством JI. К. Эрнста, получены трансгенные овцы с геном химозина, в 1 л молока которых содержится 200 — 300 мг химозина — основного компонента для производства сыра. Стоимость его будет в несколько pаз ниже продукта, получаемого традиционным способом из сычуга молочных телят и ягнят. Приведены данные, свидетельствующие о высокой эффективности производства сыра с использованием химозина молока трансгенных овец. Так, из 3 л молока трансгер ной овцы можно получить достаточное количество химозина д/ производства 1 т сыра из коровьего молока.